Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Характеристика структуры на основании значений ^-фактора низкоспиновых состояний

Как уже говорилось, у производных гемоглобина, характери­зующихся сильной связью с центральным атомом железа, на 3d-Орбиталях'; имеется только один неспаренный электрон и, следовательно, их полный спин S = г/2. Значения g фактора, соответствующие переходам Ms = +:1/2 в этом основном состоя­нии, распределяются около значения g-фактора свободного элек* трона; общая картина такого распределения, наблюдаемая на азиде миоглобина, приведена на фиг. 110, А. Можно видеть, что в этом случае основное значение g фактора равно 2,80, т. е. близко it значению^ соответствующему нормали ijjeMa, но аксиальная симметрия отсутствует; величина g-фактора в пло­скости йема изменяется очень значительно — от минимума 1,72 до максимума 2,22. Таким образом, можно определить направле­ния, соответствующие трем главным значениям g-фактора,— gK Gy и Gz. Естественно возникаетЗпредполояфние, что анизотропия g-фактора в плоскости гема ес'т. ь результат взаимодействия с каки - ми-то элементами структуры, располагающимися по обе стороны от этой плоскости Таким элементом, который располагается в непосредственной близости от центрального атома железа и может поэтому влиять на его орбитали, является прежде всего атом азота, находящийся в пятом координационном полои|ении и принадлежащий л/истиди ну, черер который гем связывается с полипептидными цепями белка. Другим таким структурным элементом является атом азота в шестом координационном поло­жении, входящий;, в состав азидной группы. По-видимому, либо азоттгистиддна, расположенного по одну сторону плоскости 'гема, либо азот азидной группы, расположенной по другую ее сторону, взаимодействуют с орбиталями атома железа, что и приводит к анизотропии g-фактора в самой плоскости к'.ема

Для того чтобы понять природу такого взаимодействия, обра­тимся вновь к фиг. 92.Жак указывалось в разд. 6.2 (фиг.90—92), орбитали окружающих л и г а я д шш томов вызывают значительное смещение энергетических уровней d-орбиталей атома железа. В частности, р-орбитали атомов азота в пятом или шестом коорди­национном положении могут в значительной степени взаимодей­ствовать с Dzx- или Dv z - о р бит а ля м и, что приведет к переходу их в более высокоэнергетические состояния. Из фиг. 92 ясно видно, что если р-орбиталь лигандного азота располагается вдоль оси х, увеличивается энергия Dzx-Орбитали атома железа, при расположении же этой орбитали вдоль оси у увеличивается энер­гия орбитали DlJz. Анализ наблюдаемых в азидном производном значений g-фактора методом молекулярных орбит показывает, что при данных значениях g-фактора d-орбиталь, соответствую­щая направлению наибольшего значения g-фактора в плоскости гема, должна представлять собой высшую орбиталь группы Tzg. Так, если максимальное значение g-фактора в плоскости гема, равное 2,22, связано с ^-направлением, анализ методом молеку­лярных орбит показывает, что высшей орбиталью t2g группы будет d^-орбиталь и, следовательно, р-орбиталь азота гистидина будет параллельна оси у. Так как плоскость гистидинового кольца перпендикулярна р-орбитали своего собственного азота, она будет располагаться вдоль оси х (фиг. 110, Б).

До сих пор мы рассматривали действие р-орбитали азота, находящегося в пятом координационном положении; но наряду с этим может иметь место взаимодействие и с р-орбиталью азота в шестом координационном положении, принадлежащего к азидной группе. Сначала предполагалось, что три атома азота азидной группы располагаются вдоль нормали гема и, следовательно, не должны вызывать анизотропии g-фактора в плоскости гема. Однако рентгеноструктурные исследования 122] показали, что атомы азота азида расположены на прямой, составляющей угол 111° с нормалью гема, и проецируются на плоскость гема так, как показано на фиг. 110, В. В этом случае электронная плот­ность на р-орбиталях атома азота шестой координационной связи, перпендикулярных азидной группе, может быть весьма значи­тельной и, следовательно, азидная группа будет вызывать ани­зотропию g-фактора в плоскости гема точно так же, как и гистидин. Экспериментально было обнаружено, что направление, соответ­ствующее минимальному значению g-фактора в плоскости гема, лежит примерно посредине между проекциями гистидиновой и азидной групп; это дает основание предполагать, что наблю­даемая анизотропия g-фактора объясняется влиянием обеих групп. В настоящее время анизотропия g-фактора подробно исследована на цианиде и других ковалентно связанных производных миогло­бина и гемоглобина, и это позволяет легко дифференцировать эффект, вызываемый гистидин ом, и эффекты, вызываемые дру­гими группами, находящимися в шестом координационном поло­жении.

А — основные значения g-фактора относительно плоскости гема. Аксиалпая сим­метрия отсутствует, g-фактор в самой плоскости изменяется от 1,72 до 2,22; Б - BBainj модействш р-орбитали атома азота гистидина с dijz-орбиталью атома желе а. Высокое значение £-факт|ора вдоль оси Оу означает, что щлоскосгь гистидинового кольца парал­лельна Ох, В — ориентация азидной группы относительно плоскости г»ма

Приведенные выше результаты ясно показывают, что, опреде­лив значения g-фактора в трех взаимно перпендикулярных пло­скостях на ковалентно связанных низкоспиновых производных гемоглобина и проведя сложную обработку результатов мето­дами теории молекулярных орбит, можно получить очень ценную дополнительную информацию как о структуре молекулы гемогло­бина, так и о характере связей центрального атома железа.

Хотя в предыдущих двух разделах основное внимание было уделено исследованиям монокристаллов, следует заметить, что во многих случаях характерные значения g-фактора высоко - и низкоспиновых состояний можно использовать как средство идентификации также в поликристаллических и жидких образцах. В этом можно убедиться, обратившись к работе Морита и Мэзона (23], посвященной состоянию атома железа в различных перокси - дазах. Исследуя замороженные растворы пероксидаз в диапазоне температур 80—180 К, авторы показали, что поглощение при g = 6,0 и g = 2,0 имеет место во всех образцах. Температурная зависимость поглощения ясно показала, что существует некое тепловое равновесие между низко - и высокоспиновыми состоя­ниями и что соотношение между ними зависит также от вели­чины рН. Более того, превращение во фторпроизводное приводило - к сужению сигналов с g-фактором, равным 6, что свидетельствует о полном исчезновении низкоспинового состояния, тогда как производные, содержащие ковалентно связанное железо (циа­ниды, азиды и гидроокиси), давали гораздо более интенсивные сигналы в области g = 2,0.

Описанные эксперименты ясно показывают, что метод ЭПР можно применять как для исследования гемсодержащих белков в условиях, близких к условиям in vivo, так и для более специфи­ческих исследований на монокристаллах.