Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Направление будущих исследовании

Описанные в этой главе исследования находятся еще на самой начальной, предварительной стадии, и о многих возможностях использования в биологии таких методов, как ДЭЯР и спин - метка, мы еще, конечно, не знаем. Но нельзя не видеть, насколько быстро внедряются всевозможные разновидности ЭПР-спектро - скопии в биохимические и биологические эксперименты. Вполне возможно, что именно в этой области применение метода ЭПР окажется особенно плодотворным. Поскольку сейчас намечаются лишь первые шаги в освоении этого обширного поля исследований, по-видимому, нет смысла пытаться в деталях предсказать окон­чательную форму, которую они примут, или наиболее вероятные пути, по которым они будут развиваться. Тем не менее в заклю­чение нелишне будет, по-видимому, высказать некоторые общие соображения относительно того, в решении какого рода проблем целесообразно в будущем применять метод ЭПР, и указать воз­можности и некоторые ограничения самого метода.

Во-первых, очевидно, что обычные методы наблюдения и ана­лиза спектров ЭПР будут играть все возрастающую роль в иссле­довании механизма радиационного повреждения. Это единствен­ный метод, который позволяет проникнуть непосредственно в центр повреждения и дает возможность следить как за возник­новением таких центров, так и за процессами появления и мигра­ции образующихся далее вторичных центров. Хотя в настоящее время точной однозначной характеристике отдельного центра повреждения мешает плохое разрешение сверхтонких линий, несомненно, что эти характеристики будут все более и более уточ­няться по мере увеличения количества записываемых и обрабаты­ваемых спектров. Накопление такой основополагающей инфор­мации происходит непрерывно, и поэтому точность интерпретации спектров ЭПР (например, спектра того типа, который сейчас связывают с защитной функцией атомов серы) будет все время повышаться. В связи с этим надо отметить, что ЭПР-исследования монокристаллов биологических молекул всегда будут иметь огромное значение хотя бы потому, что с их помощью можно прове­рять правильность интерпретации результатов, полученных на ра­створах или в других условиях,.более близких к условиям in vivo.

Другая область, в которой метод ЭПР будет, очевидно, приме­няться все более и более интенсивно в ближайшие годы,— это энзимология. Преимущества метода ЭПР в исследовании фер­ментных систем были уже продемонстрированы в гл. 5. Приведен­ные там примеры показывают, насколько велики возможности ЭПР при изучении различных свойств ферментативных реакций. Особое достоинство метода заключается в том, что он дает воз­можность очень специфически охарактеризовать взаимодействую­щие атомы или группы и, исходя из кинетики отдельных проме­жуточных продуктов, выявить последовательные стадии, через которые идет реакция. На примере ксантиноксидазы были пока­заны различные способы, с помощью которых может быть полу­чена информация как об активности свободных радикалов, так и об изменениях валентности ионов металлов в процессе катализа. В ближайшем будущем область такого рода исследований, несомненно, распространится на множество других ферментных систем. Измерения на ферментах прекрасно иллюстрируют основ­ные преимущества метода ЭПР для биохимии, поскольку в этих случаях может быть использована новейшая техника (методы непрерывного потока и быстрого замораживания) и проведен строгий теоретический анализ (расчет g-фактора и величины сверхтонкого расщепления), дающий прямую информацию о характере связей и природе ионов металлов в этих системах.

ЭПР-исследования структуры непосредственного окружения метаболически активного парамагнитного иона и характера его связей, несомненно, будут продолжаться не только на ферментах, но и на многих других металлоорганических молекулах. В гл. 6 на примере работ, выполненных с различными белками, содер­жащими медь и железо (в частности, с гемоглобином и его произ­водным!), было показано, какого рода информацию можно полу­чить, изучая монокристаллы этих белков. Но, пожалуй, самое важное, что демонстрируют все эти работы,— это несомненное преимущество, которое дает использование разных методов для решения какой-либо одной проблемы. Эта общая идея о приме­нении многих физических и химических методов при исследовании биологических объектов породила целый ряд новых направлений, совокупность которых сейчас называют «молекулярной биоло­гией», и ЭПР-исследования биохимических молекул занимают в этой области далеко не последнее место. Кардинальные измене­ния в наших представлениях о биологических структурах и меха­низмах никогда не основывались на результатах, полученных с помощью какого-либо одного метода; новые области исследова­ния открывались, как правило, в результате одновременного применения нескольких методов — либо новых, либо старых, но использованных по-новому. Прекрасным примером плодотвор­ности такого взаимодействия различных методов может служить сочетание ЭПР-спектроскопин и рентгеноструктурного анализа при исследовании гемоглобина. Вполне возможно, что в будущем истинная ценность метода ЭПР проявится именно при сочетании его с другими методами, которое и приведет нас к более полному пониманию строения и функции биологических молекул. В связи с этим следует упомянуть в заключение об одном новом методе, который уже применялся совместно с ЭПР-спектроскопией и в дальнейшем будет, вероятно, применяться все чаще и чаще.

Этот метод известен под названием спектроскопии Мёссбауэ - ра или, иначе, ядерного гамма-резонанса (ЯГР). Хотя значения длин волн, используемых в этом методе и в методе ЭПР, очень далеки друг от друга, мы кратко опишем принципы, на которых он основан, чтобы показать, каким образом результаты, полу­ченные с его помощью, можно применять для интерпретации неко­торых ЭПР-измерений. По сути, информация, получаемая в ЯГР - сиектроскоиии, ничем не отличается от информации, получаемой в ЭПР-спектроскопии, так как в обоих случаях измеряется влия­ние молекулярного или кристаллического окружения на энерге­тические уровни центрального парамагнитного атома. В ЭПР-спек­троскопии эти энергетические уровни часто определяются путем прямого измерения переходов между ними, а в спектрах Мёссбауэра они проявляются в виде очень тонких расщеплений на гораздо больших энергетических переходах, связанных с излу­чением и поглощением у-лучей - Но для молекулярной физики и физики твердого тела важны именно эти тонкие расщепления, так как по их величине можно судить о химическом состоянии и характере связей атома, которому принадлежит ядро.

В большинстве случаев разрешить такое тонкое расщепление в обычных у-спектрах совершенно невозможно, поскольку отдача излучающего или поглощающего ядра полностью маскирует очень тонкие различия в энергии, соответствующие взаимодей­ствиям в твердых телах. Эффект, который был открыт Мёссбауэром и носит его имя, состоит в том, что в некоторых случаях отдача ядра полностью поглощается окружающей решеткой или моле­кулой и, следовательно, энергия отдачи рассеивается по многим ядрам. Такое коллективное взаимодействие настолько уменьшает энергию отдачи отдельного ядра, что ширина у-Линии становится очень малой и появляется возможность разрешать очень тонкие взаимодействия в твердых. телах. К сожалению, условия, необ­ходимые для такого распределения энергии отдачи по всей решет - 5 ке, очень специфичны, и потому этот эффект можно наблюдать

Лишь на ядрах с подходящей системой энергетических уровней. Число таких ядер сравнительно невелико, но к ним, в частности, относится ядро Fe57, играющее важную роль во многих биологи­ческих молекулах. И хотя до сих пор с помощью ЯГР-спектро - скопии исследовались только железосодержащие биологические молекулы, эта область спектроскопии не столь уж ограничена, как могло бы показаться на первый взгляд, поскольку в число этих молекул входят гемоглобин и его различные производные [22, 23], цитохромы [24], перокеидазы [25, 26] и многие белки, содержащие негемииовое железо [27, 28].

Как и во всех видах абсорбционной спектроскопии, для иссле­дования ЯГР-спектров необходим источник у~излУчения опре­деленного частотного диапазона. Таким источником строго моно-

19—1182

Хроматического ^'-излучения может служить само ядро Fe57, нахо­дящееся в возбужденном состоянии. Обычно в качестве источника используют радиоактивный изотоп Со67 (период полураспада 267 дней); при распаде его ядро превращается в возбужденное ядро Fe57, которое затем переходит в основное состояние с испу­сканием у-лучей соответствующей длины волны.

Изменение длины волны в требуемом диапазоне можно осуще­ствить очень просто, воспользовавшись эффектом Допплера, кото­рый состоит, как известно, в том, что при движении источника длина волны испускаемого им излучения изменяется - Более того, в первом приближении это изменение линейно зависит от скорости движения. Как ни странно, скорости, требуемые для наблюдения эффекта Мёссбауэра, очень малы, и простое движе­ние источника со скоростями, изменяющимися в диапазоне + 10 мм/с, обеспечивает диапазон частот, соответствующий всем обычным взаимодействиям в твердых телах. Такие очень низкие скорости обусловлены очень высокой энергией у-лучей и очень малой (по сравнению с ней) энергией взаимодействий в твердых телах.

Таким образом, основные принципы и методы ЯГР-спектроско - пии относительно просты. Источник Co57/Fe57 монтируют таким образом, чтобы его можно было передвигать с указанными ско­ростями, и, направляя испускаемые им у-лучи на образец, реги­стрируют спектр поглощения их образцом, как в обычной спек­троскопии. Хорошим примером, иллюстрирующим применение метода Мёссбауэра для исследования биологических соединений, служит работа Ланга и Маршалла [22] по гемоглобину. Эти авторы изучили большое число различных производных Гей7-гемоглоб ни а крысы (животные получали изотоп с кормом). Результаты этих исследований можно разделить на две основные группы, соот­ветствующие производным двухвалентного и трехвалентного железа. В первом случае наблюдалось только расщепление, обу­словленное ядерным квадрупольным взаимодействием (фиг. 123, Л). Простой дублет, наблюдаемый на восстановленном гемоглобине, возникает в результате взаимодействия квадрупольного момента ядра Fe67 с электростатическим полем его молекулярного окру­жения.

При записи спектров Мёссбауэра трехвалентных производных гемоглобина наблюдается дополнительное расщепление. На фиг. 123, Б показаны спектры, полученные на фторпроизвод - ном гемоглобина; это производное находится в высокоспиновом состоянии S = 5/г, и для него характерно значительное расще­пление в нулевом поле. Это дополнительное расщепление, полу­ченное в спектре Мёссбауэра, можно использовать для измере­ния D (константы расщепления в нулевом поле) и проверить его, записывая спектры Мёссбауэра в присутствии внешнего

.

Магнитного поля. Ана*гщз таких спектров (фиг. 123, В) [221 дает значения D около 7 см сравнимые с величинами, полученными методом ЭПР Ланг и Маршалл Г22] исследовали этим мето­дом самые разнообразные производные гемоглобина и сравнили свои собственные выводы о состояниях энергетических уровней в атоме ркелеза с данными, полученными ранее на основе ЭПР измерений.

Поскольку эта книга не имеет прямого отношения к спектрам Мёссбауэра как таковым, излагать здесь подробно способы их обработки и выводы, к которым они приводят, не имеет смысла. Но даже качественное описание результатов показало бы, что полученные этим способом данные о тонком расщеплении энерге­тических уровней, обусловленном взаимодействием молекуляр­ного окружения с атомом железа, можно непосредственно связать с информацией, получаемой методом ЭПР. Таким образом, эти два вида спектроскопии могут успешно дополнять друг друга в исследованиях ^железосодержащих биологических молекул.

Основная цель этоии последней* главы заключалась по суще­ству в том, чтобы продемонстрировать взаимосвязь разнообразных методов, используемых в настоящез время для подробного иссле­дования биологических соединений. Развитие современной моле­кулярной биологии и биологической науки вообще все в большей степени зависит от внедрения точных методов исследования, кото­рые ранее были достоянием лишь физики и химии, а ныне стали неотъемлемой частью биологии Очевидно, что высокая точность характерна для всех новых методов, применяемых в этой растущей области науки. Так, например, именно точные измерения интен - сивностей и углов на рентгенограммах и возможность обрабаты­вать и анализировать эти данные с помощью ЭВМ позволили выяснить трехмерную структуру очень сложных биологических молекул. Точно так же очень высокая точность измерения энерге­тических уровней, доступная в спектроскопии Мёссбауэра, поз­вонила провести подробный расчет ядерно-молекулярного взаимо­действия внутри самих биохимических молекул. Аналогичным образом высокая точность определения микроволновой частоты И напряженности магнитного поля в ЭПР-спектроскопии позво­лила точно дифференцировать явления анизотропии ^-фактора и сверхтонкого расщепления в спектрах свободных радикалов или ионов металла. Огромные возможности ЭПР-спектроскопии в биологических исследованиях основаны именно на том, что она представляет собой очень специфичный метод, позволяющий определять неспаренные электроны и, следовательно, коротко - живущие радикалы и другие парамагнитные центры и точно характеризовать их.

В заключение можно сказать, что применение ЭПР в этих областях науки яьляется очень хорошим примером нового пути, по которому развивается сама наука. Методика эксперимента была открыта не так давно физиками и поначалу использовалась в чисто физических исследованиях, а затем была взята на воору­жение химиками. Строгая теория молекулярных орбиталей и поля лигандов была создана в основном химиками-теоретиками. Сейчас мы видим, что и методика, и теория ЭПР, разработанные физиками и химиками, быстро вторгаются в область молекулярной биологии. Таким образом, совместно со многими другими идеями и методами исследования метод ЭПР идет от одной области науки к другой, содействуя их объединению в единое целое.

[1] Относительной шумовой температурой называется отношение шумо­вой температуры к комнатной температуре 290 К.— Прим. ред.