Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний


Для того чтобы точно определить ориентацию молекулярных плоскостей, ЭПР-исследования изучаемых соединений необходимо, естественно, проводить на монокристаллах. Достаточно крупные монокристаллы можно вырастить из многих биохимически важных веществ, в частности из гемоглобина и различных его производных. В своих первых работах Перутц [17] и Кендрью [16] показали, что можно вырастить монокристаллы гемоглобина и миоглобина достаточно больших размеров для проведения рентгеноструктур - ных исследований. Используя специальную технику выращива­ния [18], удается получить монокристаллы правильной формы,
у которых длина граней во всех трех направлениях достигает нескольких миллиметров. Легче всего такие крупные монокристал­лы правильной формы выращиваются в случае миоглобина каша­лота. Впервые методику получения монокристаллов из мышц кашалота разработали Кендрыо и Пэриш [19] в Кавендишской лаборатории. Конечную стадию кристаллизации миоглобина про­водят в буферном растворе сульфата аммония или в фосфатном буфере при рН 7. В первом случае растут кристаллы типа А

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 99. Кристаллы миоглобина (тип А). А — форма кристалла; Б — кристаллографические оси; В ■— элементарная ячейка.

Видны хорошо выраженные грани, соответствующие плоскости аЬ, и ось с.

(фиг. 99), имеющие огранку алмазного типа и характеризующиеся хорошо выраженной кристаллографической гранью аЪ ось с Образует с этой гранью угол, близкий к прямому. В фосфатном буфере растут кристаллы совершенно иной формы (тип В), кото­рые мы рассмотрим ниже.

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

В элементарную ячейку кристаллической структуры типа А входят две молекулы миоглобина, каждая из которых содержит один атом железа и одну гемогруппу. Следовательно, в таком кристалле имеются две различно ориентированные гемогруппы, и потому следует ожидать, что в спектрах ЭПР будут выявлены два набора значений g-фактора. Чтобы получить полную трех­мерную картину взаимного расположения этих наборов, кристалл типа А вначале помещают в цилиндрический резонатор Нщ так, чтобы кристаллографическая плоскость аЪ располагалась парал-

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

320" О'

40° SO" 120° 160° 200" Угол с ото а

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

320° 0° 40° 80" 120° Угол с осью Ъ

160" 200°

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

280° 320' С' АО" Угол с Осью а

120"

Фиг» 100. Изменения величины G-фактора в зависимости от направления для кристаллов окисленного миоглобина (тип А). Объяснение см. в тексте.

Лельно нижней горизонтальной поверхности резонатора, и, вращая внешнее магнитное ноле во всех направлениях относительно плоскости Ab, определяют, как изменяется g-фактор в этой плос­кости. Результаты таких измерений приведены на фиг. 100, А, Где можно видеть две кривые изменения g-фактора, соответствую­щие двум молекулам миоглобина, входящим в элементарную ячейку. Легко убедиться, что максимальное значение g-фактора для каждой из них равно 6, так как любая кристаллографическая плоскость независимо от ее ориентации должна пересекаться с плоскостью гема по меньшей мере в одном направлении. Мини­мальное наблюдаемое значение g-фактора никогда, однако, не бывает равно 2,0, так как одна из нормалей гемогрупп, соот­ветствующих g||, не лежит в самой кристаллографической плос­кости ab. На основании минимального значения G = 2,64, наблю­даемого в случае, когда нормаль составляет с осью а угол 23°, можно определить угол 6 между направлением, соответствующим этому минимальному значению, и нормалью к плоскости гема. Из уравнения

Ge = 4 (1 8 sin2 6) (6.6)

Следует, что угол 6 составляет 17°30'. Таким образом, для опре­деления направления нормали к плоскости гема достаточно измерить минимальную величину g-фактора в плоскости Ab и знать ориентацию, соответствующую этой величине.

Однако, как правило, для проверки полученных таким спосо­бом результатов проводятся измерения в других кристаллогра­фических плоскостях. На фиг. 100 приведены также данные, полученные для плоскостей Be и ас. При изменении направления магнитного поля относительно плоскости be g-фактор в этой плоскости очень мало отклоняется от максимальной величины 6,0, и это понятно, если принять во внимание, что ориентация обеих гемогрупп очень близка к ориентации плоскости be. В плоскости Ас диапазон изменения величины g-фактора вновь становится очень большим, так как ориентация этой кристаллографической плоскости, как и плоскости Ab, близка к направлению нормали к плоскости гема. Поскольку эта плоскость является плоскостью симметрии, на которую обе гемогруппы проецируются одинаково, в этой плоскости наблюдается лишь единственная кривая измене­ния g-фактора. Проведя количественный анализ изменения вели­чины g-факторов в этих плоскостях, можно, как и в случае пло­скости ab, определить ориентацию обеих плоскостей и тем самым осуществить проверку результатов, полученных при измерениях в плоскости Ab. Ориентация двух гемогрупп, определенная таким способом, показана на фиг. 101, А. Как уже упоминалось выше, этот результат был получен методом ЭПР раньше, чем были про­ведены рентгенографические исследования миоглобина [20],

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 101. Ориентация плоскостей гемогрупп

(тип А).

ЖЙЙШШЩ11Ж И нормалям,

Ная^на основании Дан^^^^^^ апредета-

В кристечле миоглобина

И во многом помог этим исследованиям; полная структура моле­кулы миоглобина, выведенная на основании данных рентгено - структурного анализа, представлена на фиг. 101, Б.

Такого рода результаты, получаемые при анализе трехмерной диаграммы изменения g-фактора, по которой определяется напра­вление нормалей к плоскости гема, лучше представлять с помощью стереографических проекций, обычно используемых в рентгенов­ской кристаллографии. В этом методе направления в трехмерном пространстве представляются в виде точек на плоскости. Принцип построения стереографической проекции проиллюстрирован

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 102. Стереографическая проекция изменения G-фактора. А — принцип построения стереографической проекции; Б — стереографическая проек­ция для кристалла типа А.

[100] Б

Р

А

На фиг. 102, где в качестве примера взят кристалл миоглобина типа А. Вокруг кристалла рисуется воображаемая сфера и каждое направление проецируется из начала координат, где находится кристалл, на поверхность сферы. Полученные на сферической поверхности точки проецируются затем на экваториальную пло­скость сферы путем соединения их с нижним полюсом сферы, обозначенным Р. Таким образом направление в трехмерном пространстве однозначно представляется единственной точкой, лежащей в экваториальной плоскости {¥ на фиг. 102, Б).

Из фиг. 102, Б видно также, что оси а [100] и Ъ [100] грани Ab (001) кристалла миоглобина, лежащей в горизонтальной плоскости, пересекают сферическую поверхность на линии экватора и точки, соответствующие двум этим направлениям, лежат на окружности стереографической проекции. В то же время, поскольку кристал­лы миоглобина типа А моноклинны, ось с [100] не совпадает с нор­малью к плоскости ab и пересекает сферическую поверхность за верхним полюсом; поэтому соответствующая точка на стерео­графической проекции смещена относительно центра. Из фиг. 102
ясно также, что истинная ориентация общего направления ОХ, представленного на стереограмме точкой Y, определяется двумя углами 0 и ф и что величины этих углов можно непосредственно определить по положению точки Y на стереографической проекции.

Из всего сказанного следует, что направление нормали к пло­скости гема соответствует единственной точке на стереографиче­ской проекции, так как для данной гемогруппы существует только одно направление, в котором значение g-фактора уменьшается до 2,0, В то же время все направления, соответствующие g = 3,0, будут лежать на поверхности конуса, образующая которого соста­вляет угол 23° с нормалью гема, и, следовательно, на стереогра­фической проекции соответствующие точки образуют окруж­ность, охватывающую точку G = 2,0. Подобным же образом все направления, соответствующие G = 4, будут лежать на поверх­ности конуса, образующая которого составляет угол 38° с нормалью гема; направления же, соответствующие G = 6,0, т. е. направле­ниям, лежащим в самой плоскости гема, будут составлять прямой угол с нормалью гема, и соответствующие точки будут, следова­тельно, лежать на большом круге сферы; их проекции можно легко найти с помощью обычной сетки Вульфа.

Стереографическая проекция, на которой нанесены области расположения различных значений g-фактора (см. фиг. 103 для кристаллов миоглобина типа А), дает полную картину измене­ния величины g-фактора во всех направлениях в трехмерном пространстве. При исследовании кристаллов миоглобина и гемо­глобина сначала по экспериментальным точкам строят такую стереографическую проекцию, а затем определяют на ней точки, соответствующие g = 2,0. Проще всего сделать это, воспользо­вавшись тем, что полученные для различных кристаллографиче­ских плоскостей точки, соответствующие величине g = 6,0, попадают на большой круг, и поэтому нормали можно прямо найти с помощью обычной сетки Вульфа. Однако, как будет пока­зано ниже, существуют некоторые ромбические компоненты, которые приводят к отклонению величины g-фактора от 6,0; поэтому, чтобы определить направление нормали гема с макси­мальной точностью, строят ряд последовательно уменьшающихся окружностей, соответствующих последовательно уменьшающимся величинам g-фактора, пока не будет получена единственная точка, отвечающая g = 2,0. Как указывалось выше, для расчета ориен­тации нормалей гема можно не прибегать к стереографической проекции, а произвести простую подстановку в уравнение (6.6). Однако метод построения стереографических проекций обладает тем преимуществом, что на них непосредственно представлена вся ЭПР-информация относительно исследуемых кристаллов и ею легко могут воспользоваться другие исследователи, работающие в этой области.

За работой на кристаллах типа А миоглобина кашалота после­довал ряд работ, проведенных на миоглобиновых кристаллах других типов, полученных из самих различных источников [21]. Пространственную ориентацию гемогрупп в этих разных кристал­лах определяли точно так же, как и в кристаллах типа А; полу­ченные результаты можно изобразить непосредственно, как на фиг. 101, А, либо в виде только что описанных стереографи­ческих проекций.

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 103. Полная стереографическая проекция, описывающая изменения

Величины G-фактора в кристаллах типа А. Направления нормалей гемогрупп соответствуют двум точкам IIJ и II Jj, для которых

G = 2,0.

Сравним данные, полученные на кристаллах типа В и F. Кристаллы обоих типов имеют орторомбическую форму, обладают пространственной группой Р^г^ и содержат четыре молекулы на одну элементарную ячейку. Таким образом, следует ожидать, что в таких кристаллах при вращении магнитного поля будут наблюдаться четыре различные кривые изменения g-фактора; на фиг. 104 приводятся кривые такого рода, полученные при вра­щении магнитного поля относительно кристалла типа F в пло­скости, содержащей одну нормаль к плоскости гема. Можно видеть, что для этой гемогруппы g-фактор изменяется во всем

К

Диапазоне от 2,0 до 6,0 (кривая Г), тогда как кривая IV почти не отклоняется от значения G 6,0, так как она соответствует нормали, образующей с плоскостью вращения угол 84°. В высокой симметрии обоих типов кристаллов легко убедиться, обратившись к стереографическим проекциям, представленным на фиг. 105, Б И 106, Б; здесь же изображена пространственная ориентация нормалей в кристаллах обоих типов. Так как оба кристалла отно­сятся к орторомбическому типу, все три кристаллографические оси у них взаимно перпендикулярны, и существенное различие между кристаллами типа В и F заключается лшпь в величине угла, который составляют нормали гемогрупп с плоскостью аЪ

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Угол поворота

Фиг. 104. Кривые изменения величины G-фактора для кристалла типа F в плоскости, содержащей нормаль гема.

Объяснение см. в тексте.

И осыо с. Это ясно видно и на фиг. 105, А и 106, А, но очевидно, что приведенные на тех же фигурах стереографические проекции дают значительно более обширную и детальную информацию.

Вслед за начальными работами на кристаллах миоглобина были проведены ЭПР-исследования и на кристаллах гемоглобина, в частности гемоглобина лошади [15]. Как уже говорилось выше, молекула гемоглобина содержит 4 гема, т. е. 4 атома железа. В кристаллах гемоглобина лошади на элементарную ячейку при­ходится всего одна молекула гемоглобина. До проведения ЭПР-измерений предполагалось, что плоскости всех четырех гемо­групп в молекуле гемоглобина параллельны друг другу, но резуль­таты первых же измерений показали, что это не так. Типичный кристалл гемоглобина лошади показан на фиг. 107; можно видеть, что грани (110) и (001) хорошо выражены и могут быть легко иден­тифицированы. Изменения величины g-фактора в двух этих пло­скостях для окисленного производного показаны на фиг. 108. Четыре различные кривые изменения g-фактора в каждой из этих

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

А


Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 105 Ориентация гемогрупп в кристалле типа В.

А — пространственная ориентация нормалей; J3 — сферическая проекциг Сплошные дуги соответствуют значени см g-фактора, равным 6, 5 4 и*^ для. одной пары нормалей, пун - Нг - - значениям g-фактора, равным 6 и 3, для друюй nai _ юрм шеи] Дентры дуг g = 5 обозначены черными точками, g = 4 - треугольниками, д =,.3 - ромби­ками Hanpai теши нормали гема, при которых g = 2, обозначены кружком с крестиком.

Иоо] Б

16—1182

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Ъ

А


Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 10Q.1 Ориентация гемогрупп в кристаллу типа F. Л — пространственная :орйентш5ш ШтормайеЙ;, Б — стереографическая проекция Для всех четырех гемоР^пп 'построены дута соответствующие ыючешюм i'-фактора рав­ным 6 (сплошные'хфнип), 5 (прерывистые лили) и (пункта^). ОбоАтаченьГ центры этих дуг (обозначения те же, что на ф,;г. ц5): монЬо 'taiefe; что'они^ежйС^дьух irepe - 1ЯГс^ающихс! г(прямых проходящих через „fn.

Е

Плоскостей соответствуют четырем различно ориентированным гемогруппам, входящим в состав молекулы. В плоскости (100) две из четырех кривых достигают своего абсолютного минимума — величины 2,0, что сразу же позволяет определить направление нормалей двух гемогрупп. Для отыскания ориентации двух других гемогрупп можно провести количественный анализ,

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг. 107. Кристалл гемоглобина лошади.

Видны хорошо выраженные грани (001) и (ПО).

Описанный выше для кристаллов миоглобина, или же воспользо­ваться стереографическими проекциями. Полученные результаты представлены на фиг. 109, А и Б.

Можно убедиться еще раз, что метод ЭПР дает возможность однозначно определить ориентацию всех четырех гемогрупп (напомним, что эти данные были получены до проведения деталь­ного рентгеноструктурного анализа этих кристаллов). Описанная работа по определению ориентации гемогрупп в производных мио - и гемоглобина служит хорошим примером того, насколько плодотворным может оказаться сочетание таких двух различных методов, как ЭПР и рентгенокристаллография.

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Следует иметь в виду, что в этих исследованиях изменения g-фактора использовались только в качестве показателя сим­метрии относительно оси, проходящей через плоскость гема. Никакой необходимости в расчете истинных величин g-фактора

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг - 108. Изменения G фактора для кристалла гемоглобина.

А — изменение g-фактора в плоскости (001) Можно видет^ что две из четырех кривых достигают зна" i = 2,0, что сразу же позволяем покали овать ориентации соот­ветствующих нормалей; В — изменение ''-фактора в плоскости (110). Положение точки, соотве тв""ющей — 2 в этой плоско! ..т оз] пя локализовать нормаль к другой

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Угол с осью а А

Гемогруппе (кривая А).

С* с

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

А

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Фиг 109. Ориентация гемогрупп в кристалле гемоглЛкча. А - пространствен я ЛИЯ нэрмалей" В - стереографическая пргекция, Нор - Тали чстьГ1,е'- гемогрупп Щ хстэвлеяы точками Нл, Нр, Яс, Нд.

При этом не было, аргументация целиком основывалась на данных по определению симметрии и на том, что значение g-фактора в направлении, параллельном оси, сильно отличалось от значения в перпендикулярном направлении. В следующем разделе мы увидим, что такого рода анализ можно продолжить и дальше. Зная истинные значения g-фактора вдоль различных направлений, можно определить величину расщепления энергетических уровней в разных группах электронныхлорбиталей центрального атома •железа и таким образом получить дополнительные сведения о структуре окружения этого атома.

Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Направление будущих исследовании

Описанные в этой главе исследования находятся еще на самой начальной, предварительной стадии, и о многих возможностях использования в биологии таких методов, как ДЭЯР и спин - метка, мы еще, конечно, …

Метод спин-меток

В разд. 7.1 уже упоминалось о том, что метод спин-меток был специально разработан для исследований биологических молекул. Этим он отличается от всех других методов ЭПР-спектроскопии, которые были разработаны ранее и …

Применение метода ДЭЯР

Вопрос о том, каким образом принцгп и. технику метода ДЭЯР,', описанные в разд. 3.8 и. 3.9, можно приложить к исследованию биохимических систем, лучше всего, по-видимому, рассмотреть на примере экспериментов с …

Как с нами связаться:

Украина:
г.Александрия
тел./факс +38 05235  77193 Бухгалтерия
+38 050 512 11 94 — гл. инженер-менеджер (продажи всего оборудования)

+38 050 457 13 30 — Рашид - продажи новинок
e-mail: msd@msd.com.ua
Схема проезда к производственному офису:
Схема проезда к МСД

Оперативная связь

Укажите свой телефон или адрес эл. почты — наш менеджер перезвонит Вам в удобное для Вас время.