Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Определение ориентации гемогрунп на основании значений «/-фактора высокоспиновых состояний

Для того чтобы точно определить ориентацию молекулярных плоскостей, ЭПР-исследования изучаемых соединений необходимо, естественно, проводить на монокристаллах. Достаточно крупные монокристаллы можно вырастить из многих биохимически важных веществ, в частности из гемоглобина и различных его производных. В своих первых работах Перутц [17] и Кендрью [16] показали, что можно вырастить монокристаллы гемоглобина и миоглобина достаточно больших размеров для проведения рентгеноструктур - ных исследований. Используя специальную технику выращива­ния [18], удается получить монокристаллы правильной формы,
у которых длина граней во всех трех направлениях достигает нескольких миллиметров. Легче всего такие крупные монокристал­лы правильной формы выращиваются в случае миоглобина каша­лота. Впервые методику получения монокристаллов из мышц кашалота разработали Кендрыо и Пэриш [19] в Кавендишской лаборатории. Конечную стадию кристаллизации миоглобина про­водят в буферном растворе сульфата аммония или в фосфатном буфере при рН 7. В первом случае растут кристаллы типа А

(фиг. 99), имеющие огранку алмазного типа и характеризующиеся хорошо выраженной кристаллографической гранью аЪ ось с Образует с этой гранью угол, близкий к прямому. В фосфатном буфере растут кристаллы совершенно иной формы (тип В), кото­рые мы рассмотрим ниже.

В элементарную ячейку кристаллической структуры типа А входят две молекулы миоглобина, каждая из которых содержит один атом железа и одну гемогруппу. Следовательно, в таком кристалле имеются две различно ориентированные гемогруппы, и потому следует ожидать, что в спектрах ЭПР будут выявлены два набора значений g-фактора. Чтобы получить полную трех­мерную картину взаимного расположения этих наборов, кристалл типа А вначале помещают в цилиндрический резонатор Нщ так, чтобы кристаллографическая плоскость аЪ располагалась парал-

Фиг» 100. Изменения величины G-фактора в зависимости от направления для кристаллов окисленного миоглобина (тип А). Объяснение см. в тексте.

Лельно нижней горизонтальной поверхности резонатора, и, вращая внешнее магнитное ноле во всех направлениях относительно плоскости Ab, определяют, как изменяется g-фактор в этой плос­кости. Результаты таких измерений приведены на фиг. 100, А, Где можно видеть две кривые изменения g-фактора, соответствую­щие двум молекулам миоглобина, входящим в элементарную ячейку. Легко убедиться, что максимальное значение g-фактора для каждой из них равно 6, так как любая кристаллографическая плоскость независимо от ее ориентации должна пересекаться с плоскостью гема по меньшей мере в одном направлении. Мини­мальное наблюдаемое значение g-фактора никогда, однако, не бывает равно 2,0, так как одна из нормалей гемогрупп, соот­ветствующих g||, не лежит в самой кристаллографической плос­кости ab. На основании минимального значения G = 2,64, наблю­даемого в случае, когда нормаль составляет с осью а угол 23°, можно определить угол 6 между направлением, соответствующим этому минимальному значению, и нормалью к плоскости гема. Из уравнения

Ge = 4 (1 8 sin2 6) (6.6)

Следует, что угол 6 составляет 17°30'. Таким образом, для опре­деления направления нормали к плоскости гема достаточно измерить минимальную величину g-фактора в плоскости Ab и знать ориентацию, соответствующую этой величине.

Однако, как правило, для проверки полученных таким спосо­бом результатов проводятся измерения в других кристаллогра­фических плоскостях. На фиг. 100 приведены также данные, полученные для плоскостей Be и ас. При изменении направления магнитного поля относительно плоскости be g-фактор в этой плоскости очень мало отклоняется от максимальной величины 6,0, и это понятно, если принять во внимание, что ориентация обеих гемогрупп очень близка к ориентации плоскости be. В плоскости Ас диапазон изменения величины g-фактора вновь становится очень большим, так как ориентация этой кристаллографической плоскости, как и плоскости Ab, близка к направлению нормали к плоскости гема. Поскольку эта плоскость является плоскостью симметрии, на которую обе гемогруппы проецируются одинаково, в этой плоскости наблюдается лишь единственная кривая измене­ния g-фактора. Проведя количественный анализ изменения вели­чины g-факторов в этих плоскостях, можно, как и в случае пло­скости ab, определить ориентацию обеих плоскостей и тем самым осуществить проверку результатов, полученных при измерениях в плоскости Ab. Ориентация двух гемогрупп, определенная таким способом, показана на фиг. 101, А. Как уже упоминалось выше, этот результат был получен методом ЭПР раньше, чем были про­ведены рентгенографические исследования миоглобина [20],

Фиг. 101. Ориентация плоскостей гемогрупп

(тип А).

ЖЙЙШШЩ11Ж И нормалям,

Ная^на основании Дан^^^^^^ апредета-

В кристечле миоглобина

И во многом помог этим исследованиям; полная структура моле­кулы миоглобина, выведенная на основании данных рентгено - структурного анализа, представлена на фиг. 101, Б.

Такого рода результаты, получаемые при анализе трехмерной диаграммы изменения g-фактора, по которой определяется напра­вление нормалей к плоскости гема, лучше представлять с помощью стереографических проекций, обычно используемых в рентгенов­ской кристаллографии. В этом методе направления в трехмерном пространстве представляются в виде точек на плоскости. Принцип построения стереографической проекции проиллюстрирован

На фиг. 102, где в качестве примера взят кристалл миоглобина типа А. Вокруг кристалла рисуется воображаемая сфера и каждое направление проецируется из начала координат, где находится кристалл, на поверхность сферы. Полученные на сферической поверхности точки проецируются затем на экваториальную пло­скость сферы путем соединения их с нижним полюсом сферы, обозначенным Р. Таким образом направление в трехмерном пространстве однозначно представляется единственной точкой, лежащей в экваториальной плоскости {¥ на фиг. 102, Б).

Из фиг. 102, Б видно также, что оси а [100] и Ъ [100] грани Ab (001) кристалла миоглобина, лежащей в горизонтальной плоскости, пересекают сферическую поверхность на линии экватора и точки, соответствующие двум этим направлениям, лежат на окружности стереографической проекции. В то же время, поскольку кристал­лы миоглобина типа А моноклинны, ось с [100] не совпадает с нор­малью к плоскости ab и пересекает сферическую поверхность за верхним полюсом; поэтому соответствующая точка на стерео­графической проекции смещена относительно центра. Из фиг. 102
ясно также, что истинная ориентация общего направления ОХ, представленного на стереограмме точкой Y, определяется двумя углами 0 и ф и что величины этих углов можно непосредственно определить по положению точки Y на стереографической проекции.

Из всего сказанного следует, что направление нормали к пло­скости гема соответствует единственной точке на стереографиче­ской проекции, так как для данной гемогруппы существует только одно направление, в котором значение g-фактора уменьшается до 2,0, В то же время все направления, соответствующие g = 3,0, будут лежать на поверхности конуса, образующая которого соста­вляет угол 23° с нормалью гема, и, следовательно, на стереогра­фической проекции соответствующие точки образуют окруж­ность, охватывающую точку G = 2,0. Подобным же образом все направления, соответствующие G = 4, будут лежать на поверх­ности конуса, образующая которого составляет угол 38° с нормалью гема; направления же, соответствующие G = 6,0, т. е. направле­ниям, лежащим в самой плоскости гема, будут составлять прямой угол с нормалью гема, и соответствующие точки будут, следова­тельно, лежать на большом круге сферы; их проекции можно легко найти с помощью обычной сетки Вульфа.

Стереографическая проекция, на которой нанесены области расположения различных значений g-фактора (см. фиг. 103 для кристаллов миоглобина типа А), дает полную картину измене­ния величины g-фактора во всех направлениях в трехмерном пространстве. При исследовании кристаллов миоглобина и гемо­глобина сначала по экспериментальным точкам строят такую стереографическую проекцию, а затем определяют на ней точки, соответствующие g = 2,0. Проще всего сделать это, воспользо­вавшись тем, что полученные для различных кристаллографиче­ских плоскостей точки, соответствующие величине g = 6,0, попадают на большой круг, и поэтому нормали можно прямо найти с помощью обычной сетки Вульфа. Однако, как будет пока­зано ниже, существуют некоторые ромбические компоненты, которые приводят к отклонению величины g-фактора от 6,0; поэтому, чтобы определить направление нормали гема с макси­мальной точностью, строят ряд последовательно уменьшающихся окружностей, соответствующих последовательно уменьшающимся величинам g-фактора, пока не будет получена единственная точка, отвечающая g = 2,0. Как указывалось выше, для расчета ориен­тации нормалей гема можно не прибегать к стереографической проекции, а произвести простую подстановку в уравнение (6.6). Однако метод построения стереографических проекций обладает тем преимуществом, что на них непосредственно представлена вся ЭПР-информация относительно исследуемых кристаллов и ею легко могут воспользоваться другие исследователи, работающие в этой области.

За работой на кристаллах типа А миоглобина кашалота после­довал ряд работ, проведенных на миоглобиновых кристаллах других типов, полученных из самих различных источников [21]. Пространственную ориентацию гемогрупп в этих разных кристал­лах определяли точно так же, как и в кристаллах типа А; полу­ченные результаты можно изобразить непосредственно, как на фиг. 101, А, либо в виде только что описанных стереографи­ческих проекций.

Сравним данные, полученные на кристаллах типа В и F. Кристаллы обоих типов имеют орторомбическую форму, обладают пространственной группой Р^г^ и содержат четыре молекулы на одну элементарную ячейку. Таким образом, следует ожидать, что в таких кристаллах при вращении магнитного поля будут наблюдаться четыре различные кривые изменения g-фактора; на фиг. 104 приводятся кривые такого рода, полученные при вра­щении магнитного поля относительно кристалла типа F в пло­скости, содержащей одну нормаль к плоскости гема. Можно видеть, что для этой гемогруппы g-фактор изменяется во всем

К

Диапазоне от 2,0 до 6,0 (кривая Г), тогда как кривая IV почти не отклоняется от значения G — 6,0, так как она соответствует нормали, образующей с плоскостью вращения угол 84°. В высокой симметрии обоих типов кристаллов легко убедиться, обратившись к стереографическим проекциям, представленным на фиг. 105, Б И 106, Б; здесь же изображена пространственная ориентация нормалей в кристаллах обоих типов. Так как оба кристалла отно­сятся к орторомбическому типу, все три кристаллографические оси у них взаимно перпендикулярны, и существенное различие между кристаллами типа В и F заключается лшпь в величине угла, который составляют нормали гемогрупп с плоскостью аЪ

И осыо с. Это ясно видно и на фиг. 105, А и 106, А, но очевидно, что приведенные на тех же фигурах стереографические проекции дают значительно более обширную и детальную информацию.

Вслед за начальными работами на кристаллах миоглобина были проведены ЭПР-исследования и на кристаллах гемоглобина, в частности гемоглобина лошади [15]. Как уже говорилось выше, молекула гемоглобина содержит 4 гема, т. е. 4 атома железа. В кристаллах гемоглобина лошади на элементарную ячейку при­ходится всего одна молекула гемоглобина. До проведения ЭПР-измерений предполагалось, что плоскости всех четырех гемо­групп в молекуле гемоглобина параллельны друг другу, но резуль­таты первых же измерений показали, что это не так. Типичный кристалл гемоглобина лошади показан на фиг. 107; можно видеть, что грани (110) и (001) хорошо выражены и могут быть легко иден­тифицированы. Изменения величины g-фактора в двух этих пло­скостях для окисленного производного показаны на фиг. 108. Четыре различные кривые изменения g-фактора в каждой из этих

А

16—1182

Ъ

А

Плоскостей соответствуют четырем различно ориентированным гемогруппам, входящим в состав молекулы. В плоскости (100) две из четырех кривых достигают своего абсолютного минимума — величины 2,0, что сразу же позволяет определить направление нормалей двух гемогрупп. Для отыскания ориентации двух других гемогрупп можно провести количественный анализ,

Фиг. 107. Кристалл гемоглобина лошади.

Видны хорошо выраженные грани (001) и (ПО).

Описанный выше для кристаллов миоглобина, или же воспользо­ваться стереографическими проекциями. Полученные результаты представлены на фиг. 109, А и Б.

Можно убедиться еще раз, что метод ЭПР дает возможность однозначно определить ориентацию всех четырех гемогрупп (напомним, что эти данные были получены до проведения деталь­ного рентгеноструктурного анализа этих кристаллов). Описанная работа по определению ориентации гемогрупп в производных мио - и гемоглобина служит хорошим примером того, насколько плодотворным может оказаться сочетание таких двух различных методов, как ЭПР и рентгенокристаллография.

Следует иметь в виду, что в этих исследованиях изменения g-фактора использовались только в качестве показателя сим­метрии относительно оси, проходящей через плоскость гема. Никакой необходимости в расчете истинных величин g-фактора

Фиг - 108. Изменения G фактора для кристалла гемоглобина.

А — изменение g-фактора в плоскости (001) Можно видет^ что две из четырех кривых достигают зна" i = 2,0, что сразу же позволяем покали овать ориентации соот­ветствующих нормалей; В — изменение ''-фактора в плоскости (110). Положение точки, соотве тв""ющей — 2 в этой плоско! ..т оз] пя локализовать нормаль к другой

Гемогруппе (кривая А).

Фиг 109. Ориентация гемогрупп в кристалле гемоглЛкча. А - пространствен я ЛИЯ нэрмалей" В - стереографическая пргекция, Нор - Тали чстьГ1,е'- гемогрупп Щ хстэвлеяы точками Нл, Нр, Яс, Нд.

При этом не было, аргументация целиком основывалась на данных по определению симметрии и на том, что значение g-фактора в направлении, параллельном оси, сильно отличалось от значения в перпендикулярном направлении. В следующем разделе мы увидим, что такого рода анализ можно продолжить и дальше. Зная истинные значения g-фактора вдоль различных направлений, можно определить величину расщепления энергетических уровней в разных группах электронныхлорбиталей центрального атома •железа и таким образом получить дополнительные сведения о структуре окружения этого атома.