Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Методы исследования неповторяющихся процессов

В двух последних разделах рассматривались методы усредне­ния, дающие возможность повысить чувствительность ЭПР-спек - трометров при регистрации статических сигналов и таких быстро меняющихся сигналов, которые можно воспроизводить любое число раз. Часто, однако, особенно в биохимических и биологи­ческих исследованиях, точное повторение реакции оказывается невозможным, так что описанные выше методы интегрирования становятся неприменимыми. Для таких случаев необходимы какие - то специальные методы. Один из сравнительно простых способов ■состоит в том, что исследуемую реакцшо проводят в потоке газа или жидкости в трубке; при этом динамическая концентрация промежуточных короткоживущих продуктов изменяется по длине трубки, и ее величина в различных точках трубки может служить показателем кинетики реакции. Общая схема соответствующего прибора изображена на фиг. 32. Допустим, что исследуется взаимодействие какого-то фермента с его субстратом. Сначала
nf>;t раствора находятся в отдельных резервуарах (1 и 2) и всту­пают в контакт только после открывания кранов 4 и 5, веду­щих в смесительную камеру 3. Здесь растворы хорошо пере­мешиваются и идут по выходной трубке 6 через прямоугольный волновод, служащий резонатором спектрометра. При постоянной спорости поступления реагентов в смесительпую камеру ско­рость потока смеси в вы­ходной трубке также оудет постоянной. Сле­довательно, каждой точ­ке, расположенной на расстоянии х от смеси­тельной камеры, будет соответствовать опреде­ленное время, прошед­шее после начала реак­ции, т. е. после того, как оба раствора при­шли в соприкосновение. Поэтому в разных точ­ках трубки 6 динамиче­ская концентрация ко - роткоживущих проме­жуточных продуктов будет различной и, из­меряя эти концентрации на различных расстоя­ниях х, можно получить кинетическую зависи­мость изменения концен­трации от времени реак­ции. В принципе это дает возможность исследовать кинетику реакции, изменяя расстояние между смесительной камерой и резо­натором и регистрируя в каждом случае интенсивность сигнала поглощения.

На основе этого общего принципа были созданы приборы двух основных типов. В одном из них непосредственно использована описанная выше схема (подробное описание см. в разд. 3.4.2), в другом она несколько модифицирована. Реакционная смесь, вместо того чтобы идти непосредственно в резонатор, подвергается мгновенному глубокому замораживанию на определенном рас­стоянии по длине трубки, а следовательно, в определенный момент времени после смешивания растворов; такое глубокое замораживапие полностью блокирует реакцию, и полученные замороженные образцы можно потом в любое время исследовать на ЭПР-спектрометре. Этот метод рассмотрен в разд. 3.4.3.