Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования ксантиноксидазы

Мы уже говорили о том, что одной из главных групп фермен­тов является группа окислительных ферментов (оксидоредуктазы), включающая дегидрогеназы и оксидазы. В эти две подгруппы входит ряд очень важных и интересных ферментов, и не удиви­тельно, что многие из них подробно изучались методом ЭПР. Особенно тщательно была изучена ксантиноксидаза молока. Крат­кий обзор результатов, полученных в этих исследованиях, даст представление о том, какого рода информацию можно получить, с помощью метода ЭПР.

В состав ксантиноксидазы входят флавин, ионы железа и мо­либдена. Поэтому были основания предполагать, что в процессе катализируемых ею реакций наряду с образованием свободных радикалов должны иметь место изменения валентности атомов, железа и молибдена и потому исследования методом ЭПР в этих случаях будут весьма эффективными. Ксантиноксидаза удобна для исследования методом ЭПР также и потому, что ее получают из молока, доступного в любых количествах.' Этот фермент можно получить в высокоочищенном состоянии и в очень больших коли­чествах в течение всего нескольких дней. Кроме того, известно, что при определенных условиях хранения он не утрачивает ак­тивности в течение нескольких месяцев. Первые ЭПР-исследова - ния ксантиноксидазы молока были проведены Брэем с сотр. [8]. В 1959 г. им удалось показать, что при восстановлении наблю­даются два разных сигнала ЭПР. У одного из них значение g-фак- тора было очень близко к значению g-фактора свободного элек­трона, и поэтому этот сигнал был отнесен к флавиновому радикалу; значение g-фактора второго сигнала было равно 1,97 и было при­писано пятивалентному атому молибдена Мо5+ [далее обозначае­мому Mo(V)].

Дальнейшие исследования [9, 10] показали, что на самом деле спектр ЭПР ксантиноксидазы состоит из четырех ЭПР-сигналов — двух уже описанных, относящихся к флавину и Mo(V), и двух других с значениями g-фактора 4,2 и 1,9. Оба эти сигнала были отнесены к атомам железа — первый к его окисленной форме, а второй к восстановленной. Но затем обнаружилось, что пове­дение первого сигнала не согласовывалось с кинетикой других
компонент, и потому было предположено, что он обусловлен примесным железом; это кажется вполне вероятным, поскольку в биологических образцах очень часто присутствует в виде при­меси трехвалентный ион желе­за. В дальнейшем Брэй сов­местно с Байнертом и Пальме - ром [11, 12] изучили кинетику второго сигнала (g — 1,9) зна­чительно более подробно. Они применяли технику быстрого замораживания, что позволяло проследить кинетику сигналов ЭПР с временными интервала­ми порядка миллисекунд. В этих исследованиях были обнару­жены по меньшей мере четыре различных сигнала, время воз­никновения и исчезновения ко­торых исчислялось миллисекун­дами; это дало основание пред­полагать, что они связаны с самим ходом ферментативной реакции.

Типичная картина кинетики этих четырех сигналов уже бы­ла показана на фиг. 36 в каче­стве иллюстрации к методу быстрого замораживания. Мож­но видеть, что сигнал свобод­ных радикалов флавина (кри­вая I) растет очень быстро в течение первых 20 мс, после чего проходит резкий максимум и затем падает в течение не­скольких сотен миллисекунд. Из двух компонент сигнала Mo(V) одна достигает точки перегиба менее чем через 20 мс (кривая III) а другая — толь­ко через 50 мс (кривая II). Сигнал железа (кривая IV) Также растет гораздо медлен­нее и достигает максимума че­рез 100 мс. Эти сигналы, записанные в виде первой производной, показаны на фиг. 81. На спектре А, полученном до начала реак­ции ксантиноксидазы с ксантином, можно различить лишь слабое
поглощение в области G = 2,00, соответствующей свободному электрону. Спектры Б — Д получены спустя разное время после начала реакции (Б — через 26 мс и Д — через 1400 мс). Сложные спектры Б и В представляют собой совокупность всех четырех сигналов. По прошествии 1400 мс некоторые сигналы почти пол­ностью исчезают и сохраняется лишь сигнал, обусловленный железом.

В области значений g-фактора 1,95—1,97 спектр имеет слож­ную структуру, изменяющуюся в ходе восстановления фермента. Из этой сложной структуры можно вычленить по меньшей мере два сигнала, состоящие каждый, из двух компонент и обладающие разной кинетикой. На фиг. 81 одна пара компонент обозначена - а. и Р, другая — у и б. Было показано, что можно получить спектры, содержащие либо только ос - и f$-, либо только у - и б-компоненты. Первые наблюдаются в тех случаях, когда реакция протекает при рН 6,0, вторые — при рН 9,6. Тщательный анализ структуры этих разделенных сигналов показал, что оба они обусловлены различными химическими разновидностями ионов Mo(V). Этот вывод основан на том, что в обоих случаях хорошо разрешается их сверхтонкая структура, обусловленная взаимодействием неспа­ренных электронов с ядром молибдена, особенно в случае у - и 6-сиг - аалов [12]. В табл. 3 указывалось, что 75% общего числа изотопов молибдена обладают ядерным спином, равным нулю. Поэтому их спектр ЭПР представляет собой одиночную нерасщепленную линию. Но помимо этого изотопа, имеется еще 25% Мо9Б и Мо97, ядерный спин которых равен Б/2 и которые, следовательно, должны давать спектр, состоящий из шеста сверхтонких линий.

Для подкрепления этой интерпретации Брэй и Меривезер [13] в последующих работах получили препарат ксантиноксидазы ■с повышенной концентрацией изотопа Мо9Ь. Увеличение доли итого изотопа должно было привести к возрастанию интенсивности сигнала со сверхтонкой структурой из шести линий и, следова­тельно, либо подтвердить, либо отвергнуть предположение, что эти сигналы обусловлены молибденом. Сначала пробовали искус­ственно ввести в фермент обогащенный этим изотопом молибден, используя методы химического обмена, но эти эксперименты окон­чились неудачей. Поэтому были предприняты попытки получить меченый фермент посредством прямого биологического синтеза. В этих экспериментах Мо95 вводили животному и затем спустя некоторое время выделяли из молока этого животного фермент с включенным в него изотопом. Для определения степени вклю­чения изотопа в ксантиноксидазу к вводимому раствору добавляли небольшое количество радиоактивного Мо90. Было найдено, что если корове весом 546 кг однократно ввести 184 мг натриевой соли Мо"6 и 310 мкКи Мо99, то в течение 72 ч после инъекции полу­чается молоко с высокой радиоактивностью, из которого можно выделять ксантиноксидазу. Измерения радиоактивности показали, что в фермент включается 68% введенного изотопа, так чтс в конеч­ном счете около 75% общего числа изотопных атомов молибдена в полученном препарате ксантиноксидазы обладают ядерным спи­ном.

Далее на этих препаратах с повышенным содержанием Мо95 были повторены эксперименты по разделению сигналов а, Р и у, б. Сначала методом быстрого замораживания растворов при рН 10 были получены сигналы у и б, которые наблюдались спустя очень короткое время (порядка 10 мс) после начала реакции На фиг. 82 показан сигнал ЭГ1Р от обогащенного Мо95 фермента (кривая II) и для сравнения — спектр обычного фермента (кри­вая I). Хорошо видно, что после обогащения фермента Мо95 компоненты у и б приобретают отчетливую хорошо разрешенную сверхтонкую структуру из шести линий. Можно отметить значи тельную анизотропию g-фактора; значение Gz равно 2,025, a Gx и Gv Равны соответственно 1,951 и 1,956. Хорошо видно, что сверх­тонкая структура из шести лиши расположена симметрично отно­сительно положения по полю Gz и что возрастание интенсивности сверхтонких компонент сопровождается ослаблением центральной линии. Эти результаты не только окончательно подтверждают, что сигналы у и б обусловлены ионом молибдена, но на их основе, исходя из наблюдаемых значений G фактора, можно предполо­жить, что Мо(У) входит в состав кубической структуры со слабым ромбическим искажением. Кроме того, кажется вполне вероятным, что среди лигандов имеется один или несколько атомов серы, возможно принадлежащих цистеиновому остатку в белке.

Таким я<е образом исследовались сигналы а и Р, и также уда­лось показать, что они связаны с ионами молибдена; кроме того, результаты этих экспериментов позволили предположительно определить природу лигандов Мо95. Описанная работа иллюстри­рует, каким образом можно использовать анализ сверхтонкой структуры в ферментативных исследованиях, даже если образцы находятся в жидком или, как в данном случае, в замороженном состоянии. Очень интересна примененная авторами техника биоло­гического обогащения фермента изотопами, обладающими ядер нымз сиинамз.

На фиг. 83 схематически изображен механизм ксантинокси дазной реакции, построенный яа основе ЭПР-исследований. Вер­тикальные колонки представляют различные окислительно-восста­новительные системы, а горизонтальные прямоугольников каждом из них соответствуют различным уровням окисления (полностью окисленное состояние каждой системы изображено наверху) Стрелками с соответствующим обозначением показано присоедк нение или отщепление электронов или протонов, а стрелками без обозначений — случаи, когда переноса электронов как такового нет, но происходит превращение в пределах одного и того же окис- лительно-восстановительного состояния Все промежуточные про­дукты, обнаруживаемые методом ЭПР, заключены в жирную

Рамку; моясно видеть, что метод ЭПР позволяет контролировать значительную часть стадий|этого ферментативного процесса.

Механизм действия ьц'с'антыноксидазы еще не выяснен окон­чательно, но приведенные результаты наглядно показывают пгиро-
компонентов ферментной системы, но и дает возможность на осно­вании картины сверхтонкого расщепления точно идентифициро­вать эти компоненты.