Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования алъдегидоксидазы

Мы начали с рассмотрения ксантиноксидазы потому, что этот фермент больше, чем какой-либо другой, исследовался методом ЭПР и поэтому может служить хорошей иллюстрацией различных способов использования этой техники. Но метод ЭПР применялся также для изучения многих других окислительных ферментов, в том числе альдегидоксидазы. Этот фермент очень близок к ксан- тиноксидазе как по механизму переноса электронов, так и по своей функции. Как и в случае ксантиноксидазы, спектры ЭПР альде­гидоксидазы обусловлены свободными радикалами флавинового компонента, а также ионами молибдена и железа [14]. Исследова­ние кинетики этих сигналов показало, что она близка к кинетике сигналов ксантиноксидазы, но более подробные работы [15] отчет­ливо продемонстрировали, что между двумя этими ферментами имеются существенные различия, связанные в основном с окисли - тельно-восстановительными состояниями атомов молибдена.

Кие возможности ЭПР в исследовании ферментативных реакций. Этот метод не только позволяет сопоставлять кинетику различных

Исследования алъдегидоксидазы

Фиг. 83. Схематическое изображение механизмов переноса электронов в ксаптиноксидазной реакции [11].

Объяснение см. в тексте.

Так, альдегидоксидаза печени даже в неактивном состоянии дает значительный по величине сигнал ЭПР, характерный для Мо (У). Значение g-фактора этого сигнала, соответствующее g2, Равно 1,97; сигнал обладает сверхтонкой структурой, характерной для ядра молибдена и, следовательно, может быть вполне одно­
значно приписан ионам молибдена. Более того, судя по интен­сивности таких сигналов, 25% всего присутствующего в ферменте молибдена находится в неактивном состоянии it, следовательно, не принимает участия в окислительно-восстановительных превра­щениях, связанных с ферментативной активностью. Измерения времени релаксации, описанные в гл. 7, позволили четко разде­лить эти две различные формы молибдена. Другое различие между альдегид - и ксантиноксидазами заключается в том, что в спектре альдегидоксидазы отсутствуют линии, эквивалентные у - и 6-сигналам. Кроме того, при сравнении кинетики восстанов­ленной альдегидоксидазы и альдегидоксидазы, инкубировавшейся после восстановления в течение некоторого времени, обнаружи­ваются значительные разлитая.

Эти исследования с использованием методов непрерывного потока и быстрого замораживания иллюстрируют, каким образом с помощью разных методов можно исследовать разные свойства ферментативного процесса. Так, в первой серхш измерений [16] вначале быстро смешивали фермент и субстрат, как в обычном методе непрерывного потока, и немедленно после этого смесь пере - мевшвали с буфером, насыщенным кислородом. Полученные результаты сравнивали затем с данными другой серии экспери­ментов, в которых сначала вшриц заполняли ферментом и субст­ратом в анаэробных условиях (процесс этот занимает около 20 мин), и только после этого к полученной смеси добавляли окси - генированный буфер. Было обнаружено, что в случае предвари­тельной инкубации фермента и субстрата без доступа кислорода последующему реокислению подвергаются лишь флавиновый ком­понент и ион железа, тогда как ион молибдена остается, по-види- мому, полностью инертным. Если же за процессом восстановления сразу же следует реокисление, все три компоненты сигнала ЭПР, возникающего при восстановлении (обусловленные флавином, молибденом и железом), быстро отвечают на добавку кислорода. Эти эксперименты не только подтверждают лабильность восстанов­ленного молибдена, но и приводят к предположению, что молибден является переносчиком, ближе всего расположенным к субстрату. Эксперименты, проведенные на альдегидоксидазе, позволяют заключить, что, как и в случае ксантиноксидазы, все три компо­нента — молибден, флавин и железо — участвуют в переносе элек­трона от субстрата на кислород в последовательности, указанной на фиг. 83.

Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Направление будущих исследовании

Описанные в этой главе исследования находятся еще на самой начальной, предварительной стадии, и о многих возможностях использования в биологии таких методов, как ДЭЯР и спин - метка, мы еще, конечно, …

Метод спин-меток

В разд. 7.1 уже упоминалось о том, что метод спин-меток был специально разработан для исследований биологических молекул. Этим он отличается от всех других методов ЭПР-спектроскопии, которые были разработаны ранее и …

Применение метода ДЭЯР

Вопрос о том, каким образом принцгп и. технику метода ДЭЯР,', описанные в разд. 3.8 и. 3.9, можно приложить к исследованию биохимических систем, лучше всего, по-видимому, рассмотреть на примере экспериментов с …

Как с нами связаться:

Украина:
г.Александрия
тел./факс +38 05235  77193 Бухгалтерия
+38 050 512 11 94 — гл. инженер-менеджер (продажи всего оборудования)

+38 050 457 13 30 — Рашид - продажи новинок
e-mail: msd@msd.com.ua
Схема проезда к производственному офису:
Схема проезда к МСД

Партнеры МСД

Контакты для заказов шлакоблочного оборудования:

+38 096 992 9559 Инна (вайбер, вацап, телеграм)
Эл. почта: inna@msd.com.ua