Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования алъдегидоксидазы

Мы начали с рассмотрения ксантиноксидазы потому, что этот фермент больше, чем какой-либо другой, исследовался методом ЭПР и поэтому может служить хорошей иллюстрацией различных способов использования этой техники. Но метод ЭПР применялся также для изучения многих других окислительных ферментов, в том числе альдегидоксидазы. Этот фермент очень близок к ксан- тиноксидазе как по механизму переноса электронов, так и по своей функции. Как и в случае ксантиноксидазы, спектры ЭПР альде­гидоксидазы обусловлены свободными радикалами флавинового компонента, а также ионами молибдена и железа [14]. Исследова­ние кинетики этих сигналов показало, что она близка к кинетике сигналов ксантиноксидазы, но более подробные работы [15] отчет­ливо продемонстрировали, что между двумя этими ферментами имеются существенные различия, связанные в основном с окисли - тельно-восстановительными состояниями атомов молибдена.

Так, альдегидоксидаза печени даже в неактивном состоянии дает значительный по величине сигнал ЭПР, характерный для Мо (У). Значение g-фактора этого сигнала, соответствующее g2, Равно 1,97; сигнал обладает сверхтонкой структурой, характерной для ядра молибдена и, следовательно, может быть вполне одно­
значно приписан ионам молибдена. Более того, судя по интен­сивности таких сигналов, 25% всего присутствующего в ферменте молибдена находится в неактивном состоянии it, следовательно, не принимает участия в окислительно-восстановительных превра­щениях, связанных с ферментативной активностью. Измерения времени релаксации, описанные в гл. 7, позволили четко разде­лить эти две различные формы молибдена. Другое различие между альдегид - и ксантиноксидазами заключается в том, что в спектре альдегидоксидазы отсутствуют линии, эквивалентные у - и 6-сигналам. Кроме того, при сравнении кинетики восстанов­ленной альдегидоксидазы и альдегидоксидазы, инкубировавшейся после восстановления в течение некоторого времени, обнаружи­ваются значительные разлитая.

Эти исследования с использованием методов непрерывного потока и быстрого замораживания иллюстрируют, каким образом с помощью разных методов можно исследовать разные свойства ферментативного процесса. Так, в первой серхш измерений [16] вначале быстро смешивали фермент и субстрат, как в обычном методе непрерывного потока, и немедленно после этого смесь пере - мевшвали с буфером, насыщенным кислородом. Полученные результаты сравнивали затем с данными другой серии экспери­ментов, в которых сначала вшриц заполняли ферментом и субст­ратом в анаэробных условиях (процесс этот занимает около 20 мин), и только после этого к полученной смеси добавляли окси - генированный буфер. Было обнаружено, что в случае предвари­тельной инкубации фермента и субстрата без доступа кислорода последующему реокислению подвергаются лишь флавиновый ком­понент и ион железа, тогда как ион молибдена остается, по-види- мому, полностью инертным. Если же за процессом восстановления сразу же следует реокисление, все три компоненты сигнала ЭПР, возникающего при восстановлении (обусловленные флавином, молибденом и железом), быстро отвечают на добавку кислорода. Эти эксперименты не только подтверждают лабильность восстанов­ленного молибдена, но и приводят к предположению, что молибден является переносчиком, ближе всего расположенным к субстрату. Эксперименты, проведенные на альдегидоксидазе, позволяют заключить, что, как и в случае ксантиноксидазы, все три компо­нента — молибден, флавин и железо — участвуют в переносе элек­трона от субстрата на кислород в последовательности, указанной на фиг. 83.