Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Энергетические уровни и анизотропия высокоспинового состояния

Как уже было показано, высокоспиновое состояние иона трех­валентного железа характеризуется наличием пяти неспаренных электронов, спины которых располагаются параллельно друг другу, так что полное спиновое квантовое число S = Гз/2 (фиг. 97). Этот полный спин может принимать различные ориентации по отно­шению к оси внутреннего молекулярного поля, причем возможны (2S + 1), т. е. шесть различных ориентаций, характеризующихся квантовыми числами Ms = +Б/2 и т. д. Но, согласно теореме Крамерса, уровни +5/2 и —5/2 обладают одинаковыми энергиями; поэтому эти шесть ориентаций приводят к возникновению лишь трех двукратно вырожденных энергетических уровней (фиг. 97, Б). Расщепление между этими тремя уровнями в значительной сте­пени определяется величиной и симметрией молекулярного поля, и в большинстве случаев величина расщепления мала по срав­нению с энергией используемого микроволнового кванта. Хоро­шим примером может служить ион Мп2+, часто встречающийся в качестве примеси в биохимических системах. Расщепление между тремя уровнями для солей марганца и дальнейшее расщеп­ление этих уровней при приложении внешнего магнитного поля уже обсуждалось в разд. 1.4.3 (фиг. 7). Было показано, что в этих случаях при обычных величинах напряженности внешнего маг­нитного поля в спектре ЭПР наблюдается пять групп линий, воз­никающих в результате переходов между шестью различными энер­гетическими уровнями, и что расщепление в нулевом поле, вызы­ваемое наличием внутреннего молекулярного поля, можно рас-

Мг-1

V/D

ZD

Г* Fie

Нулевое роле

Н

Б

Фиг. 97. Ориентация полного спина иона Fe3+.

А — различные ориентации полного спина S = 6/г иона Fe3+, связанного ионной связью, относительно оси молекулярного поля. По другую сторону плоскости гема расположены аналогичные три компоненты для Ms = — /2, —3/2 и —*/2; Б — энергии, соответствую­щие различным ориентациям.

Сматривать как слабое возмущение, накладываемое на картину расщепления во внешнем магнитном поле.

Для гемоглобина и родственных ему соединений дело обстоит совершенно иначе. В этом случае внутреннее молекулярное поле приводит к возникновению очень большого расщепления между тремя энергетическим! уровнями, значительно превосходящего величину обычного микроволнового кванта. Поэтому микроволно­вые кванты уже не могут вызвать переходы между высшими уров­нями и основным состоянием, и при обычных рабочих частотах ЭПР-спектрометра наблюдается лишь один резонансный переход между уровнями Ms = ±3/2 самого нижнего состояния (фиг. 98). Расчет эффективных значений g-фактора для этого основного со­стояния проводится совершенно иначе, нежели для обычного BS - основного состояния марганца. В этом случае мы уже не можем считать, что расщепление в нулевом поле между этими различными спиновыми состояниями представляет собой лишь слабое возму­щение, накладываемое на расщепление под действием внешнего магнитного поля. Ситуация оказывается диаметрально противо­положной, и ось внутреннего молекулярного поля становится эф­фективной осью квантования вместо оси внешнего магнитного поля. При наложении вненшего поля вдоль оси внутреннего поля между этими полями не возникает конкуренции и наблюдаемая величина g-фактора соответствует g-фактору свободного элект­рона, как этого и следует ожидать для синглетного состояния в отсутствие орбитального вклада. В то же время к основному со­стоянию примешиваются более высокие спиновые уровни. Это приводит к изменению величины g-фактора в направлениях, отли­чающихся от направления, соответствующего gjj, и для случая аксиальной симметрии эффективное значение получается рав­ным 6,0. Такое высокое эффективное значение Gj_ мояшо качест­венно объяснить, обратившись к фиг. 97, из которой видно, что, когда полный вектор S = 5/2 в ориентации, соответствующей основ­ному состоянию Ms =±'/2, прецессирует вокруг молекулярной оси, угол между вектором и молекулярной осью очень велик. Поэтому в направлениях, лежащих в плоскости гема (т. е. перпендикуляр­ных оси), возникает значительная намагниченность и в этих на­правлениях g-фактор должен быть очень большим. Для более точного расчета величины g-фактора нужно прибегнуть к методам квантовой механики: не вдаваясь в подробности, укажем, что для случая, когда направление магнитного поля параллельно моле­кулярной оси, вековой детерминант принимает форму

Г/-г>

( + V2I ~+yl2g[Mh-E <-Va| 0

В случае же магнитного поля, перпендикулярного молекулярной оси, вековой детерминант имеет вид

Г/2> |-х/2>

3иФнх Ц--Е

Найдя корни этих двух детерминантов, получим следующие вы­ражения для разницы энергий между двумя уровнями: для случая, когда И перпендикулярно нормали гема,

A E = gWHz /,gf<b=gj; (6.3)

Для случая, когда Н параллельно нормали гема,

АЕ = 3£РНХ. •. Gf> = 3G*. (6.4)

Здесь g* — истинное значение соответствующего g-фактора, т. е. значение, получаемое при очень малых величинах расщепления в нулевом поле, a g3** — значение g-фактора, измеряемое в экспе­рименте; далее в этой главе мы всегда будем иметь в виду именно это последнее значение. В итоге подобный расчет показывает, что, когда расщепление в нулевом поле, вызванное молекулярным полем, велико, спектр может быть описан с помощью условного спина S = 1/2, для которого g\ — 2 и = 6.

Если измерения производят с помощью ЭПР-спектрометра, работающего на очень высоких частотах, т. е. на коротких волнах, величина расщепления в нулевом поле сравнима с энергией кванта. В этих промежуточных случаях следует проводить значительно более строгий квантономеханический расчет, не прибегая к аппрок­симации; выражение для g L принимает тогда вид

G^ = 3gi[l-2(4^)2]. (6.5)

Где 2D — величина расщепления между дублетами в нулевом поле (фиг. 98). Из этого выражения следует, что чем выше используемая микроволновая частота, тем меньше получаемое в эксперименте значение gy* по сравнению с приведенным выше значением 6,0; величину этого сдвига можно использовать для оценки истинного расщепления между самими спиновыми дублетами.

Расщепление энергетических уровней при наложении магнитно­го поля в направлении, перпендикулярном внутреннему полю, показано на фиг. 98; можно видеть, как по мере увеличения напря­женности поля величина g-фактора уменьшается от 6 до 2. При анализе графика становится очевидпым, что при достаточно вы­соких микроволновых частотах можно наблюдать переходы между

SW"

Дублетом основного состояния и компонентой Ms = ±3/Z выше­лежащего дублета (следует, однако, заметить, что этот прямой переход лучше наблюдать в условиях, когда угол между направ­лением внешнего магнитного поля и нормалью к плоскости гема невелик). В последних работах на гемоглобине и его производных [14] измерения проводились именно на таких высоких частотах с целью определить отклонение от 6,0 и непосредственно измерить переходы (±3/2) — (±V2).

Но ранние работы [15] выполнялись на микроволновых часто­тах Х - или Q-диапазона, в котором значение g* было близко к 6,0; следовательно, анизотропию g-фактора для этого низшего перехода можно представить так же, как это сделано на фиг. 96, Б - Как видно из фиг. 96, Б, анизотропия g-фактора действительно представляет собой высокочувствительный метод определения ориентации плоскости гема, или иорфиринового кольца. В прин­ципе для установления ориентации плоскости гема достаточно поместить кристалл в резонатор и вращать его в разных направ­лениях, пока g-фактор не станет равным 2. Это будет служить одно­значным указанием на то, что внешнее магнитное поле направлено вдоль нормали к плоскости гема, и следовательно, будет опреде­лена ориентация самой плоскости. Однако, как показала практика, двигать кристалл в резонаторе одновременно в трех измерениях очень трудно. Поэтому кристаллы поочередно устанавливали так, чтобы магнитное поле изменялось в различных кристаллографи­ческих плоскостях, и строили кривую изменения g-фактора в каж­дой из плоскостей. Когда проводились первые ЭПР-исследования такого рода, рентгенографические работы Кендрью И б] и Пе - рутца [17] еще не были завершены и, следовательно, ориентация таких плоскостей была неизвестна. Впервые эта ориентация была определена именно с помощью метода ЭПР, и на ее основе рентге- нокристаллографы осуществили полный анализ остальной части молекулы.