Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Белки, содержащие атомы меди

Использование экспериментально полученных значений g-фак- тора и сверхтонкой структуры в исследовании природы химической связи лучше всего, пожалуй, продемонстрировать на белках, со­держащих ионы меди с разной валентностью. Как уже было ска­зано, одним из таких белков является фермент церулоплазмин, молекула которого содержит 8 атомов меди, двухвалентной и одно­валентной примерно в равных количествах (по данным химиче­ского анализа).

По предположению Мальмстрёма [5], за связывание субстрата ответствен атом одновалентной меди и перенос электрона от суб­страта на двухвалентный ион меди осуществляется с помощью Си+ через зх-связь ароматического кольца субстрата. Такой меха­низм предполагает, конечно, наличие довольно сильного взаи­модействия между двумя валентными состояниями атомов меди.

Спектр ЭПР церулоплазмина [4] характеризуется значениями gjl = 2,209 и = 2,056. Около положения £ц наблюдается хорошо разрешенная сверхтонкая структура, аналогичная той, которая изображена на фиг. 12, Б. Это соответствует константе сверхтон­кого расщепления 0,008 см-1 в направлении, соответствующем G\- Легко видеть, что в этом случае g-фактор существенно меньше отклоняется от значения, соответствующего свободному элект­рону, чем в спектрах ЭПР ионов меди, связанных простой ионной связью. Исходя из уравнения (5.1), можно, следовательно, пред­положить, что в церулогхлазмине имеется значительное количе­ство ковалентных связей. По этой же причине величина сверх­тонкого расщепления, наблюдаемого в параллельном направлении, оказывается гораздо меньшей, чем обычная, как и следовало ожидать (см. п. 2 на стр. 217). Помимо таких общих качественных соображений, можно, однако, сделать и точные количественные выводы, руководствуясь теорией, изложенной в предыдущем раз­деле. Ваннгард и Ааза [6], исходя из предположения, что на уча­стке, где локализован атом меди, поле обладает аксиальной симмет­рией и что все линии поглощения имеют лоренцеву форму, предсказали общий вид всего спектра, получающегося при интег­рировании по анизотропному g-фактору и сверхтонкой струкуре. Полученные ими теоретические значения G\ = 2,214, G± = 2,048 и А = 0,0083 см-1, хорошо совпадают с экспериментально получен­ными величинами.

Очень тщательный анализ спектров ЭПР медьсодержащих био­логических комплексов был проведен Малъмстрёмом и Ванигардом [7]. Они разработали специальную методику, позволяющую на основе полученных в эксперименте спектральных характеристик рассчитать две безразмерные константы, с помощью которых мож­
но определить тип связи иона металла; одна из этих констант за­висит от смещения g-фактора, а другая — от сверхтонкого рас­щепления. Судя по величине констант, полученных для церу - лоплазмина, его молекула характеризуется наличием сильной ковалентной связи между атомом металла и лигандами. В частности, константа, связанная со смещением g-фактора, которая в случае чисто ионной связи равна 1,0, а чисто ковалентной связи — 0,5, для церулоплазмнна равна 0,52.

Константа, определяемая из сверхтонкой структуры, также свидетельствует о сильной ковалентной связи (как уже было ска­зано, в спектре церулоплазмнна сверхтонкое расщепление в па­раллельном направлении гораздо меньше, чем в спектрах обычных солей с ионной связью). Дополнительные сведения о наличии кова­лентной связи может дать иногда и суперсверхтонкая структура, обусловленная лигандными атомами азота (фиг. 80).

Более поздние исследования Ваннгарда [8] на высокоочищен - ных препаратах церулоплазмнна показали, что, помимо линий с небольшим сверхтонким расщеплением, в спектре этого веще­ства наблюдается сигнал, также обусловленный атомами меди, но с большим сверхтонким расщеплением. В препаратах, полу­ченных путем максимально щадящей процедуры, интенсивность этого дополнительного сигнала соответствовала одному атому меди на молекулу. Эти данные приводят к предположению, что у одного из четырех атомов меди, содержащихся в молекуле церу­лоплазмнна, характер связи отличается от остальных. Для окон­чательной идентификации этих атомов и установления их локали­зации необходимы, конечно, дальнейшие исследования. Тем не менее работа Ваннгарда все же очень интересна, так как она показывает, сколь подробную информацию об истинном харак­тере химической связи атомов меди в белках можно получить, пользуясь методом ЭПР.

Этот метод может оказаться весьма полезным и в том случае, когда участок, на котором локализован атом меди (или другой атом металла переходной группы), обладает очень низкой сим­метрией, что означает наличие определенной стереохимической напряженности в комплексе. Блумберг и др. [9] исследовали спектры ЭПР стеллацианина — окрашенного в голубой цвет гли- копротейда, содержащего один атом двухвалентной меди на моле­кулу. На фиг. 94 показаны спектры ЭПР стеллацианина, полу­ченные при разных значениях рН. Можно видеть, что по мере заще - лачивания лучше разрешаются и сверхтонкая структура, обуслов­ленная атомами меди, и суперсверхтонкая структура, обусловлен­ная лигандными атомами азота.

Линия, соответствующая положению gj, имеет две главные компоненты, а также суперсверхтонкую структуру. Следовательно, электростатическое поле, действующее на атом меди, не обладает аксиальной симметрией и поэтому g-фактор не изотропен, а имеет различные значения Gx и Gv. Анализ приведенных кривых дает результаты, свидетельствующие о заметном искажении симметрии молекулярного поля по сравнению с аксиальной (gz = 2,30; Gy = = 2,06; Gx = 2,03). Для подтверждения того, что здесь имела место именно анизотропия g-фактора, а не какой-то вид сверх­тонкого расщепления, были поставлены контрольные экспери­менты по измерению спектров ЭПР в области более высоких частот.

Обнаруженное различие между величинами Gx и Gy можно объяснить, предположив, что поле лигандов обладает некоторой ромбической симметрией; о том же говорит очень интенсивное оптическое поглощение стеллацианина. Результаты измерений оптического поглощения и спектров ЭПР показывают, что по мере повышения рН симметрия молекулярного поля вокруг атома меди изменяется в две стадии. Это в свою очередь может быть связано с началом процесса денатурации белка. Дело в том, что сильная неаксиальная симметрия поля, окружающего атом меди, означает, что лигандные атомы образуют жесткую матрицу, так как в про­тивном случае они переориентировались бы таким образом, чтобы поддержать аксиальную симметрию. То обстоятельство, что не­аксиальная симметрия проявляется в щелочной области рН, поз­воляет, по-видимому, предположить, что при высоких значениях рН окружающая структура претерпевает заметные изменения, обусловленные денатурацией, т. е. изменением третичной струк­туры белка. Описанное направление исследований представляет значительный интерес, поскольку в некоторых случаях становится возможным фиксировать начало денатурации белка и нарушение аксиальной симметрии по спектрам ЭПР.