Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования дегидрогегиш

Как уже указывалось в разд. 5.3, где рассматривались общие свойства ферментативных реакций, к окислительным ферментам относят не только сами оксидазы,. но и дегидрогеназы — фер­
менты, катализирующие отщепление атомов водорода от молекулы субстрата. Некоторые из дегидрогеназ подробно изучены методом ЭПР, и ниже мы кратко обсудим результаты таких исследований.

Среди дегидрогеназ легче всего поддается изучению дегидро - геназа дигидрооротовой кислоты. Этот фермент содерлки^ лишь железо и флавин в стехиометрическом соотношении 2:2, имеет относительно низкий молекулярный вес 60 ООО и легко поддается очистке, так как может быть получен в кристаллической форме.

Кроме того, он обладает характерным оптическим спектром погло­щения. Поэтому Алеман и сотр. [17], применив метод быстрого замораживания, исследовали замороженные образцы одновре­менно двумя методами — методом ЭПР и методом отражательной спектроскопии. На фиг. 84 суммированы р^ультаты серии кине - тидёских. экспериментов, проведенных на растворе этого фермента после быстрого смешивания его с раствором НАД-Н. Изменение степени восстановления фермента в ходе реакции сопоставлено здесь с изменением интенсивности сигналов сШР свободных ради­калов и ионоЗДкелеза (степень восстановлении контролировалась по оптическому поглощению при 610 и 455 нм). Приведенные к|fuвые ясно показывают, что изменения поглощения при 610 нм во времени точно следуют [та изменением сигналов ;*ШР свобод­ных радикалов и ионавнелеза, тогдашак кривая поглощения при
455 им оказывается совершенно иной. Хотя механизм действия этого фермента окончательно еще не выяснен, подобные сравни­тельные кинетические исследования четко показывают, как соот­носятся между собой ЭПР и оптические спектры.

Методом ЭПР изучалась также сукцинатдегидрогеназа [18, 19]. Стандартизировать условия выделения этого фермента весьма трудно, и из-за его крайней лабильности никогда нет уверенности в том, что каждый раз измеряется один и тот же препарат. Однако при добавлении субстрата все же удается, как правило, наблюдать типичный свободнорадикальный сигнал, а при низких темпера­турах — и дополнительный сигнал G = 1,94, обусловленный желе­зом. Детальные исследования кинетики сукцинатдегидрогеназы, подобные тем, которые были выполнены с ксантиноксидазой, еще не проводились, и в настоящее время вряд ли можно сформули­ровать какую-нибудь правдоподобную гипотезу о механизме дей­ствия этого фермента. Это объясняется не ограниченными возмож­ностями метода ЭПР, а невозможностью приготовления стандарт­ных образцов сукцинатдегидрогеназы, обладающих одними и теми же свойствами.

С НАД •Н-дегидрогенезами, которые также являются компо­нентами дыхательной цепи митохондрий, дело обстоит примерно так же. Как и сукцинатдегидрогеназу, эти ферменты получают в виде препаратов разной степени сложности, так что результаты их исследования методом ЭПР сильно отличаются друг от друга. В спектрах более сложных препаратов при восстановлении фер­мента с помощью НАД - И всегда, как правило, обнаруживается сигнал G = 1,94, отсутствующий в спектрах препаратов, подверг­нутых спиртовой обработке при низких значениях рН. Большая серия исследований была выполнена на этих ферментах Байнертом и сотр. [20]. Результаты этих работ, а также данные, полученные на родственных ферментах, приводятся в обзорной статье Байнерта и Пальмера [21].