ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ ПИГМЕНТЫ

Во всех фотосинтезирующих клетках, за исключением фото- синтезирующих бактерий, фигурирует хлорофилл а (Chi а). В бактериях вместо Chi а наличествует бактериохлорофилл

Сн.

НС

(р

Л І, ІЩ—

}-N4 N=/

¥-

CzHs

■v*

/II I \

\>

Ч/ww ■/ і /

Н, с >

Н, с °-c\

■OCH,

\

H, C -

-CH,

\ 1 /

У—NH

MU UM

C=o

<

HC/CHz II

НгСхСН2 CHj

^:сн-снг нгсх

І—NH HN—v

I 0 0 I

CH,

C, H,

'Z"5

6)

H2CX

CH—CH3

Снг

Н2 ccT' >H

A)

HjC CHj

ВСІ

/\ CH, H5C H H

H H.

H H

.H H.

C=c' Nc=c; \ / \

H H3C

H H H H4

CHjH

4 >=< )c=cC

CH3 H, OCH

H3C CH, H \ / 3

H H

SJ

Рис. 7.3. Структурные формулы некоторых пигментов. Л—хлорофилл а. В хлорофилле Ь обведенная кружком группа СН3 заменена на —НС=0; Б—fi-каротин; В—фикоэритробилии.

В Chi. Chi а имеет сине-зеленую окраску. Менее универсально, хотя и обычно, присутствие хлорофилла b (Chi b). В литературе

Описаны и другие хлорофиллы, содержащиеся в разных типах водорослей. Строение Chi а и СЫЬ показано на рис. 7.3, Л. В ос­нове структуры находится порфириновое кольцо, ответственное за поглощение света в видимой области спектра. В центре коль­ца расположен атом Mg. Заметим попутно, что порфириновые циклы в комплексах с другими атомами фигурируют б ряде

Важнейших для биологии веществ—б геме (атом Fe), в гемоцианинах (атом Си) и др. [12].

Наряду с хлорофиллами в фотосин­тетических системах растений присут­ствуют другие окрашенные вещества, пигменты, играющие вспомогательную роль. Общим правилом является на­личие каротиноидов (рис. 7.3,Б). В красных водорослях (Rhodophycae), в сине-зеленых водорослях (Суапо - phycae) присутствуют фикобилины (ве­щества, родственные желчным пиг­ментам), содержащие разомкнутое порфириновое кольцо (рис. 7.3, В). В табл. 7.1 [1] приведены спектраль­ные характеристики хлорофиллов и других пигментов, участвующих в фо­тосинтезе.

На рис. 7.4 показаны полосы по­глощения Chi а, каротиноида, фико - эритрина и фикоцианина [1]. -

Основная проблема химии и физи­ки фотосинтеза состоит в раскрытии механизма преобразования энергии света в химическую энергию, запасаемую в синтезируемых орга­нических соединениях. Хлорофилл — вещество, определяющее фотосинтез; энергия света, им поглощенная, используется для фотосинтеза. Очевидно, что исследования указанной проблемы целесообразно начинать с простых фотохимических реакций с участием хлорофилла. Именно это направление начали с 1948 г. развивать Красновский и его сотрудники (см. [10, И]).

Реакция Красновского, открытая в 1948 г. [13], состоит в об­ратимом фотовосстановлении хлорофилла

4000 ШО ВООО 7000 Длит волны, А

Рис. 7.4. Полосы поглоще­ния хлорофилла а (/), каро­тиноида (2), фикоэритри - на (3) и фикоцианина (4).

По оси оРдниат—оптическая плотность.

О

Chi + АН СЬГ + АН+.

Тем самым, световая энергия трансформируется in vitro в хими­ческую при участии хлорофилла. Восстановителем, т. е. доно­ром электрона в этих опытах служил аскорбат. Восстановленный

Таблица 7.1 Спектральные характеристики растительных пигментов

I. Хлорофиллы Chi о

Chi b Chic Chid

Бактериовиридин

В Chi о В Chi b

II. Каротиноиды

На. Каротины а-каротин

Р-каротин

Y-каротин

Иб. Каротинолы (ксантофиллы)

Лютеол

Виолоксантол Фукоксантол

Спириллоксантол

4200, 6600

4530, 6430 4450, 6250 4500, 6900

Две формы:

4250, 6500

4320, 6600 3650, 6050, 7700

3680, 5820, 7950

В гексане 4200, 4400, 4700

В гексане 4250, 4500, 4800

В гексане 4400, 4600, 4950

В этаноле 4250, 4450, 4750

В этаноле 4250,

4500, 4750 В гексане 4250, 4500, 4750

В гексане 4640, 4900, 5240

4350, 6700- 6800 (не­сколько форм) 4800, 6500

Полоса 6450

Полоса 7400

Полосы 7500

Или 7600 Полосы 8000,

8500, 8900 Полоса 10 170

Все фотосинтезирую - щие растения кро­ме бактерий

Высшие растения и зеленые водоросли Диатомеи и бурые во­доросли Некоторые красные водоросли

Зеленые бактерии

Пурпурные и зеленые

Бактерии Штамм пурпурных бактерий Rhodop - seudomonas

Многие листья и во­доросли. Главный каротин в красных водорослях и в груп­пе зеленых водоро­слей

Главный каротин во всех других расте­ниях

Главный каротин в зе­леных серных бак­териях

Главный в зеленых и красных водорослях

Второй важнейший ка - ротинол листьев

Главный в диатомеях и бурых водорослях

Пурпурные бактерии

Таблица 7.1 (продолжение)

Хлорофилл может быть окислен вновь. По-видимому, возбужден­ные светом молекулы хлорофилла восстанавливаются in vivo за счет воды. Таким образом, главный пигмент растительных кле­ток— хлорофилл — непосредственно участвует в окислительно-

Восстановительных реакциях

т* при освещении. К этим реак-

S?- S*'

Хлорофилла

S

Х / циям относится и обратимое

Фотохимия фотоокисление

Ферри-ионом [14]:

Рис. 7.5. Схема электронных уровней хлорофилла по Красновскому [11].

Chi + Fe+++ Chi"1" + Fe"1 Каков же механизм реакции

Красновского?

На основании исследований спектров поглощения и флуо­ресценции хлорофилла и его аналогов можно считать, что элек­тронные уровни хлорофилла расположены так, как показано на рис. 7.5. В темноте молекула находится на нижнем синглетном электронном уровне S0. Полосы поглощения Chi соответствуют переходам S0->5* (в красной области) и S0—>5* (в синей об­ласти спектра). Обратный переход S*->S*— безызлучательный (показан волнистой стрелкой); флуоресценция соответствует пе­реходу S* —> So. С уровня S* возможен безызлучательный пере­ход в триплегное состояние Т, являющееся метастабильным. При поглощении света в этом состоянии Chi переходит в возбужден­ное триплетное состояние Т*. Об образовании метастабильного триплетного состояния хлорофилла свидетельствует фосфорес­ценция его замороженных растворов [15]. Схема рис. 7.5 дана в упрощенном виде, на ней не указаны колебательные уровни.

Теренин рассмотрел роль триплетных состояний в фотохимии красителей (пигментов) [16]. В этих состояниях молекула нахо­дится в неустойчивой активной конфигурации, несущей большую часть поглощенной энергии светового кванта. Такие молекулы способны эффективно участвовать в химических превращениях и в процессах миграции энергии. Роль триплетных состояний оп­ределяется большой длительностью их жизни и химической не - иасыщенностью вследствие наличия неспаренных электронов.

Соответственно, обратимое фотовосстановление хлорофилла можно представить схемой

СЫ + Й(о->СЫ*-^ - Chi • •Chi • +АН - СЬГ+ • АН+.

Точка изображает неспаренный электрон, по-видимому, делока- лизованный в системе сопряженных связей порфиринового цикла. Красновский и его сотрудники доказали методом ЭПР, что при фотовосстановлении хлорофилла возникают свободные радикалы [11, 17—20].

Как уже сказано, хлорофилл подвергается и фотоокислению, в частности, кислородом при интенсивном освещении растворов Chi на воздухе. Эти явления также были детально изучены в работах Красновского и его школы [11, 21—25].

Таким образом, хлорофилл, будучи возбужден светом, может играть роль и донора, и акцептора электрона.

ЙСй

I

—е —е

Донор <=± Chi Акцептор —е —е

Сказанное относится и к ряду других порфириновых соедине­ний— аналогов хлорофилла.

Спектр поглощения Chi a in vivo характеризуется сложным характером его красной полосы поглощения [26]. Это заставляет думать о наличии нескольких форм хлорофилла. Жизнь расте­ния несомненно связана с химическими превращениями хлоро­филла, биосинтез которого является важной особенностью фото - синтезирующих клеток (см. [27]). Красная полоса поглощения смещается, когда листья живого растения, выросшие в темноте, постепенно зеленеют на свету. Наличие нескольких форм хлоро­филла доказывается тем, что во время постепенной его экстрак­ции из листьев спектр поглощения меняется [28]. Различные формы, возможно, связаны с разными типами специфической агрегации молекул хлорофилла,

Энергия света, поглощенного хлорофиллом и другими пиг­ментами, как уже сказано, может запасаться, переноситься от молекулы одного пигмента к молекуле другого, мигрировать между тождественными молекулами, излучаться в актах флуо­ресценции и фосфоресценции и рассеиваться, превращаясь в тепло. Проблемы, связанные с этими явлениями, рассматривают­ся далее. Во всех случаях первичный акт фотохимического про­цесса состоит в поглощении света. Эффективность использова­ния энергии световых квантов, поглощенных вспомогательными пигментами, варьирует от 20 до 100% эффективности использо­вания энергии, поглощенной Chi а. По-видимому, одна из функ­ций вспомогательных пигментов со­стоит в снабжении хлорофилла а поглощенной энергией.

Количественное исследование фо­тохимического процесса требует прежде всего изучения спектра дей­ствия света, т. е. зависимости ско­рости продукции кислорода Р от числа поглощенных квантов 1а и длины волны X. Спектром действия называется функция

P/!a = f(V - (7-2)

Если Р — число молекул 02, проду­цируемых В 1 С, 1а — число кван­тов, поглощаемых в 1 с, то f(K) означает квантовый выход фо­тосинтеза, обозначаемый Ф(А). На рис. 7.6 показан график функции Ф(А,) для хлореллы [29]. Снижение квантового выхода в области 4500—5000 А, соответствующей поглощению света каротиноидами, заставляет думать, что эти вещества являются относительно слабыми сенсибилизаторами фотосинтеза. Напро­тив, в области поглощения света фикобилинами такого падения Ф(А) нет и, следовательно, фикобилины имеют такую же эффек­тивность, как и Chi а. Из анализа спектров действия следует, что эффективность каротиноидов меняется от 20 до 50% эффектив­ности Chi а, эффективность фикоэритрина — от 60 до 100%.

Длина волны, А

Рис. 7.6. Спектр действия (квантовый выход) фотосин­теза для хлореллы.

Абсолютное значение максимального квантового выхода ха­рактеризует число квантов, необходимых для выделения одной молекулы 02. Пользуясь методом дифференциальной маномет - рии, Эмерсон и Чалмерс [30] определяли порознь выделение 02 и поглощение С02 при фотосинтезе. Это было осуществлено также другими методами. Количественные данные показывают, что число квантов, поглощаемых при выделении одной моле­кулы кислорода, равно 8 (см. [1]). Отсюда следует, что для пере­носа каждого атома водорода от Н20 к С02 нужно два кванта.

По другим данным число квантов, приходящихся на молекулу Ог варьирует от 8 до 12.

Характерной особенностью кривых Ф(А) является резкое па­дение квантового выхода в длинноволновой, красной, области спектра («красное падение»). Оно наблюдается вблизи 6800 А в зеленых водорослях и вблизи 6500 А — в красных. Сходный эффект обнаруживается в спектре действия реакции Хилла [1]. Как мы увидим, объяснение красного падения не тривиально. Chi а поглощает свет в этой области. Соответственно возникает вопрос, отвечает ли красная полоса поглощения Chi а одному или нескольким электронным переходам. Если справедливо вто­рое, то одни переходы могут быть эффективными, другие — не­эффективными при фотосинтезе.

В работах лабораторий Красновского (см. [11, 31]) и Ливннг- стона [32] было показано, что хлорофилл частично агрегирует в неполярных растворителях, вероятно, образуя димеры. Примене­ние современных методов исследования — электронографии [33], инфракрасной спектроскопии и спектроскопии ЯМР к изучению агрегации пигментов позволило обосновать представление о том, что в димере образуется координационная связь карбонильной группы одной молекулы Chi с центральным атомом Mg другой молекулы [34]. Агрегированные формы Chi а и других пигментов получены в модельных системах — в концентрированных раство­рах, монослоях и пленках [35]. В модельных системах наблю­даются спектры поглощения и люминесценции, сходные с тако­выми in vivo. Установлено, что обратимые окислительно-восста­новительные фотореакции свойственны как мономерным, так и агрегированным формам (см. [11]).

Как уже указывалось, в растениях наблюдается ряд «спект­ральных форм» хлорофилла, в частности, Chi а. Среди них имеются и агрегированные. В работах Литвина и сотрудников [35, 36] установлено, что в различных фотосинтезирующих орга­низмах фигурирует один и тот же набор форм хлорофилла. Число таких форм велико, для Chi а оно более 10.

Допустим, что длинноволновая часть полосы поглощения при­надлежит димерам, Chl2, в которых происходит более быстрая конверсия энергии электронного возбуждения в колебательную энергию. В этом случае димер Chl2 малоэффективен в фотосин­тезе, и красное падение объясняется. Другое объяснение со­стоит в том, что Chi a in vivo фигурирует в нескольких формах, разнящихся положением полос поглощения, а также фотохими­ческой эффективностью и выходом флуоресценции. Действи­тельно, как показано на рис. 7.6, красная полоса Chi а состоит из двух компонентов примерно равной интенсивности, 6700 и 6800 А. Имеются указания на наличие третьего слабого компо­нента у 6950 А.

Ряд дополнительных фактов показывает, однако, что красное падение требует более сложного объяснения. Здесь очень важен эффект Эмерсона, состоящий в том, что свет, неэффективный в далекой красной области, станов. ітся полностью эффективным при одновременном освещении более коротковолновым излуче­нием, например при комбинированном воздействии светом с X 7000 и 6500 А [37]. Эффект Эмерсона показан на рис. 7.7. Дей­ствие двойного облучения неаддитивно, выделение 02 существен­но больше суммарного эффекта при освещении двумя типами излучения, примененными порознь. Количественно эффект Эмер­сона характеризуется величиной

Д02 (комбинированное — Д02 (коротковолновое

освещение) освещение) и п\

Длина волны, А

Рис. 7.7. Эффект Эмерсона

В хлорелле. 1 — график Ф (Л) при длинноволно­вом освещении, 2— график Ф (Л) при добавочном коротковолновом осве­щении.

6 Д02 (длинноволновое освещение) ' \ • /

Где ДОг — скорость выделения кислорода. Спектр действия эф­фекта, т. е. зависимость g от длины волны добавочного коротко­волнового света, показывает, что є особенно велико, когда большая часть этого света поглощается од­ним из вспомогательных пигмен­тов — Chi b в зеленых водорослях, Chi с или фикоксантолом в диато - меях и фикобилином в красных и сине-зеленых водорослях. Отсюда следует, что для полной эффектив­ности фотосинтеза нужно поглоще­ние одного кванта хлорофиллом а и другого — одним из вспомогатель­ных пигментов. Красное падение происходит в области, в которой свет поглощается только Chi а.

В красных водорослях падение квантового выхода происходит при сравнительно малой длине волны 6500 А. Это наглядно объяс­няется предполагаемым поглощением двух квантов. Красные водоросли не содержат Chi b и область поглощения Chi а простирается в них примерно до 6500 А, при более длинных вол­нах становится заметным поглощение света фикоцианином.

Однако предложенная интерпретация не свободна от неяс­ностей. Фикобилин сенсибилизирует флуоресценцию Chi а в красных водорослях. Иными словами, кванты, поглощаемые вспомогательными пигментами, переносятся на Chi а. Перенос является количественным. Остается непонятым, каким образом те же кванты могут нести иную фотохимическую функцию.

Более детальное исследование эффекта Эмерсона показало, что наряду с максимумами є (Л), соответствующими вспомога­тельным пигментам, в полосе поглощения Chi а имеется макси­мум при 6800 А (рис. 7.8) [38]. Этот результат показал, что эф­фект Эмерсона определяется поглощением одного кванта одной формой хлорофилла а и второго кванта — другой его формой. Максимумы на кривой спектра действия связаны не с поглоще­нием вспомогательных пигментов, но с резонансным переносом энергии возбуждения с этих пигментов на активную форму Chi а.

Из изложенных фактов следует гипо­теза о двух фотохимических системах, действующих в фотосинтезе — ФС / и ФС II [1, 39]. Система II флуоресцирует сильно, система / — слабо. В зеленых растениях ФС II содержит хлорофилл а с максимумами поглощения 6700 и 6800 А, но не 6950 А. ФС / содержит все эти три формы Chi а. Кванты, поглощен­ные Chi а 6700 и Chi а 6800, переносятся в ФС / на Chi а 6950 и энергия их дис- сипирует, чем и объясняется низкий вы­ход флуоресценции. Появление пика при 6700 А на кривой є (А) объясняется тем, что ФС II содержит большую долю Chi а 6700, чем ФС I.

Если две фотохимические системы сенсибилизируют две последовательные фотохимические реакции, то они должны действовать с оди­наковой скоростью. Свет поглощается одновременно в обеих системах, но в неодинаковой степени. При К > 6500 А в крас­ных водорослях и при X > 6800 А в зеленых водорослях си­стема / получает избыточную, а система II недостаточную энергию, чем и объясняется красное падение. Нарушается ба­ланс, необходимый для совместной работы двух систем. Баланс этот улучшается при одновременном освещении более коротко­волновым светом [1].

§ 7.3. ДВЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Длина волны, А

Рис. 7.8. Спектр действия эффекта Эмерсона для хлореллы.

Если световые реакции, сенсибилизированные двумя фотохи­мическими системами, происходят последовательно, то можно определить спектр поглощения каждой системы, измерив спект­ры действия фотосинтеза при сильном, но не насыщающем воздействии светом, поглощаемым другой системой. Скорость общей реакции в этом случае определяется лимитирующим
процессом. Если избыточный свет поглощается системой /, то скорость реакции, а значит, и спектр действия, лимитируется си­стемой II и наоборот. Соответствующие измерения привели к установлению спектров поглощения обеих систем (рис. 7.9) [40]. ФС II несколько богаче Chi b и Chi а 6700, ФС / содержит боль­ше Chi а 6800 и Chi а 6950. Нельзя, следовательно, считать, что Chi а 6700 служит сенсибилизатором одной фотохимической ре­акции, Chi а 6800 — другой. Обе реакции связаны друг с другом относительно медленным темновым процессом. Это доказывается тем, что эффект Эмерсона наблюдается и при вхождении в ре­акционный сосуд под прямым углом друг к другу двух лучей

То 6700 7000 в 7300 Длит ваты, Л

Рис. 7.9. Спектры погло­щения ФС / и ФС // в хлорелле.

По оси ординат — оптическая плотность.

Со.

-(СН20)

Хн.

ZH.

Рис. 7.10. Схема фотосинтеза с двумя фотохимическими стадиями, сенси­билизированными ФС / и ФС//.

Света разной длины волны. При таких условиях коротко - и длин­новолновый свет поглощается клетками водорослей в разное время. Эффект Эмерсона обнаруживается при прерывистом воз­действии света с разной длиной волны с интервалом между вспышками, достигающим нескольких секунд [41]. В красных во­дорослях Porphyridium выделение Ог при вспышке зеленого света усиливается, если ей предшествует вспышка красного света, поглощаемого Chi а в ФС/. Отсюда следует, что при этом получается долгоживущее промежуточное соединение. Время его полураспада оценивается в 18 с. Напротив, выделение Ог при вспышке красного света не усиливается, если ей предшест­вует вспышка зеленого; таким образом, зеленый свет, поглощае­мый ФС II, не создает долгоживущих промежуточных соединений.

Из сказанного следует, что общую схему фотосинтеза можно представить рис. 7.10. Мы пришли к уточнению схемы, показан­ной на рис. 7.1 [1].

Каким образом поглощенные кванты распределяются между двумя системами так, что они работают с одинаковой ско­ростью? Здесь предложены две гипотезы. Согласно первой иа
них, избыточная световая энергия, поглощенная ФС II, «перели­вается» в ФС I, но не наоборот, так как переход энергии возбуж­дения с Chi а 6950 на хлорофиллы а 6800 и 6700 затруднен вы­соким барьером. «Переливание» приводит к сбалансированному возбуждению обеих систем в области спектра, в которой больше света поглощается ФС II, чем ФС /. Оно объясняет красное па­дение при К > 6800 А, где свет поглощается главным образом Chi а 6950 в ФС/. В водорослях, содержащих фикобилин, Chi а в основном содержится в ФС I, и красное падение начинается при 6500 А.

Вторая гипотеза исходит из пространственного разделения ФС / и ФС//, находящихся в «отдельных пакетах» (см. [42]). Эта гипотеза более правдоподобна, так как пространственное разделение систем подтверждается опытами по фракционирова­нию вещества хлоропластов. Сбалансированное возбуждение оп­ределяется в этом случае не переносом энергии от ФС// к ФСI, но наличием в обеих системах одинаковых пигментов, хотя и в разных пропорциях. Квантовый выход фотосинтеза должен прн этом иметь минимумы в областях, в которых одна из систем по­глощает свет сильнее, чем другая. Соответствующая тонкая структура спектра действия была действительно обнаружена.

Изучение дифференциальных спектров поглощения дало бо­гатую информацию о двух фотохимических системах. Дифферен­циальные спектры исследуются при одновременном поглощении света, возбуждающего фотосинтез. Возбуждающий пучок на­правлен перпендикулярно к аналитическому. Исследуются из­менения в дифференциальном поглощении слабого света при наличии сильного монохроматического освещения (в частности вспышечного) по сравнению с темнотой. Дифференциальный спектр дает сведения о пигментах, испытывающих обратимые изменения при фотосинтезе. Варьируя длину волны возбужде­ния, удается получить спектр действия и определить пигменты, сенсибилизирующие изменения в поглощении. Этот метод был развит Дейзенсом [42], вспышечная техника — в работах Кока [43] и Витта [44]. Именно при помощи вспышечной техники, под­робно описанной в [44], была получена наиболее детализирован­ная информация о молекулярных событиях при фотосинтезе. Эта техника дает возможность измерять времена жизни т возникаю­щих промежуточных соединений и времена их появления и ис­чезновения в интервале от Ю-1 до Ю-8 с. Времена эти широко варьируют для разных процессов.

В клетках хлореллы и в хлоропластах зеленых растений при освещении обнаружены изменения поглощения с временем жизни т = 3 мкс и временем появления промежуточных соединений, меньшим 25 НС [45, 46]. Дифференциальный спектр этих измене­ний имеет три отрицательных пика при 4300, 4600 и 4900 А и положительный при 5200 А. Таким образом, в синей области происходит выцветание. Оно интерпретируется как переход не­коего каротиноида в метастабильную форму

<25 не

Саг >- саг*.

3 мкс

Это доказывается рядом фактов. Спектр исследуется при тем­пературах, меньших—160°С, при которых заблокированы все химические реакции. Он наблюдается при блокировке фотосин­теза добавленным ядом 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмоче - виной (ДХММ) и исчезает полностью в присутствии парамаг­нитных тушителей (02). В гексане метастабильные состояния каротиноидов характеризуются полосой 5140 А, близкой к 5200 А. Возникновение Саг* имеет очевидный биологический смысл. При избыточном освещении энергия должна диссипиро - вать, что и осуществляется через посредство Саг*. Каротиноиды защищают хлорофилл от фотоокисления при избытке света.

Изучение ФС / показало, что содержащийся в ней Chi а, обо­значаемый Chi сії, окисляется на свету. Этот процесс, представ­ляемый схемой

<:о не

Chi а, Chi а),

20 мс

Обнаруживается по появлению в дифференциальном спектре от­рицательных полос при 4380, 6600, 6820 и 7000 А [47]. Первая и последняя полосы сильные. При добавлении феррицианида к суспензиям хлоропластов амплитуды этих изменений сильно убывают. Chi а/ окисляется феррицнанидом в темноте и восста­навливается в темноте N-метилфеназониумсульфатом (МФС). В бутаноле фотоокисление чистого Chi а сопровождается появ­лением отрицательных полос при 4320 и 6660 А [48], что согла­суется с результатами, полученными Красновским [11, 49].

Очень быстрое окисление хлорофилла Chi аг показывает, что это первичный продукт. Электрон переходит с Chi а/ на НАДФ+.

Установлена стехиометрия 1: 1 окисления Chiаг и восстановле­ния НАДФ+ [43]. Восстановление Chi aj полностью блокируется ядом ДХММ. Так как этот яд специфически блокирует окисле­ние воды, то конечным донором электрона для Chi af служит вода.

Свет с К 7000 А вызывает обратимые изменения поглоще­ния Chi аг. За окислением следует восстановление в течение 20 мс. Однако в далекой красной области 7000—7300 А проис­ходит лишь окисление хлорофилла аг. Как уже сказано, свет с энергией кванта йсо/ вызывает окисление Chi aIt свет с энер­гией кванта Ъищ поглощается в ФС//, в результате чего элек­троны НгО могут быть использованы для восстановления Chi aIt Пигмент в ФС 11 может возбуждаться лишь при к < 7000 А. Это, по-видимому, также Chi а, обозначаемый Chi ап. Различие Chi aj и Chi аи, возможно, сводится к различию в их окруже­нии. Первый — «длинноволновый», второй — «коротковолновый» хлорофилл.

Время жизни Chi ал в 100 раз меньше, чем Chi aj. Тем не менее, удалось выделить реакцию Chi ац на свету, характери­зуемую отрицательными пиками при 4350 и 6820 А [50]. Схема реакции имеет вид

<20 НС

Chi a, jj ч І Chi а*

0.2 мс

Как связаны ФС / и ФС II, т. е. Chi а, и Chi аи} Окисление Н2О блокируется ДХММ. Следовательно, этот яд должен вы­зывать исчезновение обратимых изменений Chi и Chi aIIt если они связаны последовательно. В присутствии ДХММ ис­кусственный донор электронов МФС может снабдить Chi аг электронами вместо Н20. Если оба хлорофилла связаны, то МФС может реактивировать Chi а,, но не Chi ап. Это и наблю­дается в соответствии со схемой [44]:

ДХММ

МФС I

НАДФ+ ч— Chi а, Chi а„<-ЩО.

Hdi] *«>//

Приведенная схема следует из результатов, полученных с помощью импульсной методики. Не следует, однако, думать, что эта методика дает исчерпывающие данные. Если какой-либо из доноров и акцепторов электрона, участвующий в фотосин­тетической системе, не имеет соответствующей полосы погло­щения, то он может быть не замечен. Так, перенос электрона с Chi aj на НАДФ идет в действительности через ферредоксин (см. далее стр. 353).

Приводимые здесь схемы (они заимствованы у Витта [44]) нельзя считать окончательными. По мере улучшения методики и увеличения точности результатов экспериментов картина все более усложняется. Ясно, что в исследованиях сложных проблем фотосинтеза должны применяться (и применяются) различные методы, дополняющие друг друга.

Свойства Chi аг и Chi аи представлены в табл. 7.2 [44].

Таблица 7.2

Свойства хлорофиллов I и II

Связь ФС / и ФС// осуществляется посредством пластохи - нонов (ПХ). При экстрагировании петролейным эфиром хло - ропласты утрачивают способность окислять воду, но эта спо­собность восстанавливается при добавлении ПХ [51]. ПХ уча­ствуют в окислительно-восстановительных реакциях. Возбуж­денный Chi а'и восстанавливает ПХ до гидрохинона, Chi af окисляет его вновь. ПХ расположены в виде «пула», содержа­щего около пяти молекул, между ФС I и ФС II. (Подробности, относящиеся к кинетическому поведению ПХ, см. в [44], а так­же далее, см. стр. 372).

Этим дело, однако, не ограничивается. В окислительно-вос­становительной цепи две молекулы Chi ап находятся в кон­такте с двумя молекулами неидентифицированного пока что вещества X —возможно также пластохинона, но находящегося в другом окружении. Вещество X восстанавливается Chi а// и служит переносчиком электрона. Максимальные изменения в
дифференциальном спектре X — положительная полоса при 3350 А. Таким образом, получаем схему

НАДФ+ ч— Chi о, <— ПХ <— X с— Chi ап <— Н20. й<о/ Ьац

Схема эта не полна — между ПХ и Chi cij имеются промежу­точные переносчики электронов, равно как между Сhla{ и НАДФ+ (ферредоксин).

Ранее было известно, что в хлоропластах содержатся по крайней мере два цитохрома — цитохром Ь6 с окислительно-вос­становительным потенциалом, близким к 0,0 В, и цитохром f с потенциалом, близким к +0,42 В. Позднее был найден еще и цитохром Ь3 с потенциа­лом около —0,15 В. Диффе­ренциальные спектры показы­вают, что цитохромы (прежде всего цитохром /) испытывают обратимое окисление в осве­щенных- фотосинтезирующих клетках. Дифференциальный спектр цитохромов, получен­ный Дейзенсом и сотрудника­ми [52], показан на рис. 7.11. Потенциалы цитохромов промежуточны между потенциалами ФС / и ФС//, соответственно цитохромы занимают промежу­точное положение между ФС/ и ФС//. Фотоокисление цито­хрома / происходит только на свету, поглощаемом ФС/, т. е. Chi Я/ в красных водорослях. Свет, поглощаемый ФС//, т. е. фикоэритрином в красных водорослях, вызывает усиленное вос­становление окисленного цитохрома /. Другие факты, характе­ризующие роль цитохромов, приведены в [44]. Получается схема

НАДФ+ <— Chi а, ч— цит f ПХ <— X <— Chi а„ <— Н20>

40О Ц 4500 5000 Длина волны, А

Рис. 7.11. Дифференциальный спектр Цитохромов в фотосинтезирующих системах.

Й(0/ . ЙШ//

По-видимому, один из цитохромов — цитохром Ь3 — функцио­нирует в окисленной форме как первичный окислитель в ФС// [531. Он служит акцептором электронов, происходящих из Н20. Цитохром / может служить в восстановленной форме донором электронов в ФС/, передающим электрон^ на пиридин- нуклеотид. После этого цитохромы Ь3 и f взаимодействуют, при­чем снова возникает окисленное состояние первого и восстанов­ленное второго. При этом освобождается свободная энергия,

-1,0

-0,5

О

+.0,5

По

Chi ah

—і—Потеря __\энергии ФД

ФП ^ НАД?

Потеря жре/ш

Ьь)Т

Ьы„

ЧПХ

Цит£ ПЦ -

СМ aj {7000)

НгО-

Chi ац (6800)

Рис. 7.12. Энергетическая схема событий, происходящих в ФС / и ФС ii.

Пц —пластоцианин, ПХ-~иластохинон, ФД — ферредоксин, ФП —флавопротеид.

Z и Y — первичные доноры и акцепторы электронов световой реакции И, Р 700 и X — пер* вичные доноры и акцепторы электронов реакции I, Р 690 — реакционный центр ФС//, и 700 — реакционный центр ФС I, ПХ —пластохинон, ПЦ — пластоцианин, ФД —ферредоксии. По оси ординат отложены окислительно-восстановительные потенциалы в вольтах.

Равная 0,4 эВ, которая может быть использована для синтеза АТФ. На рис. 7.12 показана энергетическая диаграмма событий в ФС / и ФС// [44], а на рис. 7.13 — общая схема фотосинтеза (ср. рис. 7.10 и 7.1). Наконец, на рис. 7.14 приведена весьма детализированная схема переноса электронов от Н20 к НАДФ+ в хлоропластах [44]. На схеме указаны временные и спектро­скопические характеристики соответствующих процессов. Вре­мя окисления ПХ 20 мс является лимитирующим. Одновремен­но функционируют две цепи переноса электронов. Это доказы­вается следующими соображениями: образование пластогидро - хинона за одну вспышку, в которой переносится только один

<гимс

5555

Рис. 7.14. Схема переноса электронов от Н20 к НАДФ+ в хлоропластах [44].

Электрон, можно понять, лишь если две цепи действуют парал- тельно; первый порядок реакции исчезновения Х~ 3350 (донор электрона для ПХ) можно объяснить лишь наличием двух це­пей; кооперация двух Chi an доказывается блокированием двух центров Chi an одной молекулой ДХММ.

§ 7.4. ИССЛЕДОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Изучение спектров флуоресценции фотосинтезирующей си­стемы дает ценную информацию о ФС / и ФС//, несмотря на трудности интерпретации получаемых данных. Флуоресцирую­щая фотосинтезирующая система состоит из различных форм
пигментов, между молекулами которых возможна миграция энергии (см. далее, стр.370), что очень усложняет картину.

Квантовый выход флуоресценции Chi а составляет 30% in vitro и лишь 3—6% in vivo. В последнем случае флуоресцируют несколько форм хлорофилла а, разнящиеся спектрами испуска­ния и квантовыми выходами. Эти формы характеризуются раз­личной зависимостью флуоресценции от интенсивности осве­щения и различным образом изменяются во время индукцион­ного периода. Квантовый выход флуоресценции фикобилинов не зависит от интенсивности освещения. Энергия, запасаемая

В Chi а, может расходоваться в фотоситезе или излучаться. Малый выход флуоресценции определяется именно тем, что энергия идет на фотосин­тез.

Спектр флуоресценции Chi а показан на рис. 7.15 [1]. Главная полоса 6850 А и коле­бательный спутник 7400 А от­личаются колебательной энер­гией, отвечающей частоте 1460 см-1, характерной для де­формационного колебания СНг-группы. При сильном ос­вещении, превышающем насы­щающее для фотосинтеза, квантовый выход флуоресцен­ции примерно удваивается. Он возрастает также при низких температурах. Квантовый выход сильно меняется при быстром переносе клеток из темноты на свет во время периода индукции фотосинтеза. Изменение флуоресценции в этом периоде отра­жает работу цепи переноса электронов.

Рис. 7.15. Спектр флуоресценции хлореллы при возбуждении светом с Я 4200 А (сплошная кривая) и 4800 А

(пунктир). По оси ординат — квантовый выход флуорес­ценции в произвольных единицах.

Главная полоса испускания Chi a in vivo, обозначаемая F 685, в действительности содержит вторую более слабую ком­поненту в области 7000 А. При возбуждении клеток хлореллы светом с К 4400 А, поглощаемым Chi а, длинноволновая компо­нента сильнее, чем при возбуждении светом с X 4800 А, погло­щаемым Chi Ъ. Следовательно, полоса флуоресценции при I 7200 A (F 720) определяется ФС/. Главная полоса, напротив, относится к ФС//. В красных и сине-зеленых водорослях зеле­ный свет, поглощаемый фикобилинами, более эффективен для возбуждения флуоресценции Chi а, чем свет, поглощаемый са­мим Chi а. Фикобилины содержатся преимущественно в ФС//. Из этих фактов вновь следует, что имеются две формы хлоро­
филла а — флуоресцентная Chi йц и нефлуоресцентная (слабо флуоресцентная) Chi Я/.

Допустим, что возбуждение молекулы завершается либо излучением с вероятностью /, либо внутренней конверсией, безызлучательный переходом, с вероятностью g. Число воз­бужденных молекул п удовлетворяет дифференциальному урав­нению

N = -(f + g)n (7.4)

С решением

Л (/) = л (0) ехр [-(f+ £)/]. (7.5)

Квантовый выход излучения равен

Оо

О

Для среднего времени жизни имеем

ОО I оо

T=\tdn \ dn = 7TF - (7-7>

О і о

Следовательно, т = Фто, где то = 1// — «естественное» время жизни в отсутствие тушения при g = 0. Для Chi а то = 15 не и квантовый выход in vitro Ф = т/то = 4,5/15 = 0,3. In vivo при слабом освещении Ф = 0,05, при сильном — Ф = 0,09, тогда, как прямые измерения дают соответственно значения 0,03 и 0,06. Расхождение объясняется наличием значительной доли нефлуо - ресцирующего Chi a in vivo. Расхождение устранится, если не светится около половины всего хлорофилла а.

Спектр действия флуоресценции Chi a in vivo, т. е. зависи­мость Ф от длины волны возбуждающего света, характеризу­ется, как и следовало ожидать, красным падением. Оно начи­нается в области 6750 А. Красное падение, по-видимому, свя­зано не с Chi а 6800, а с минорной компонентой Chi а7 6950, на­личествующей лишь в ФС I, тогда как компоненты 6700 и 6800 присутствуют в обеих фотосинтетических системах и дают при­мерно равные вклады в флуоресценцию. Действительно, при деструкции Chi а 6950 при помощи ультразвука красное паде­ние исчезает.

Сложность флуоресценции Chi a in vivo подтверждается ее изменением во время индукционного периода фотосинтеза. Если клетки хлореллы подвергаются сильному освещению после длительного пребывания в темноте, выход Ф практически мгно­венно достигает некоторого уровня. Через несколько миллисе­
кунд Ф повышается примерно втрое, потом слегка убывает, за­тем достигает максимального уровня, пятикратного по сравне­нию с начальным. После этого Ф убывает до стационарного значения, достигаемого через несколько минут. Анализ такого

Поведения показывает, что за него ответственна полоса флуоресценции 6850 А, относящаяся к ФС //. Слабая флуоресценция ФС/ остается практи­чески постоянной во времени.

При низких температурах полосы флуоресценции сужаются и уменьша­ется их перекрывание. Так, при 4 К были обнаружены три длинноволно­вые полосы испускания при 6890, 6980 и 7250 А. Охлаждение способствует излучению из ловушек, энергетическая глубина которых оценивается в 1 — 2 kbТ при комнатной температуре, 5—8 kbT при 77 К и 100—150 ksT при 4 К. Полоса 6950 А, наблюдаемая лишь при температурах ниже 140 К, возможно, обусловлена эмиссией из ловушек в ФС II. Полосы 6850 и 6980 А возбуж­даются главным образом при поглощении в ФС II, а полоса 7250 А — при поглощении в ФС / [1].

В растворах хлорофилла, равно как и других красителей, интенсивность флуоресценции F пропорциональна интенсивно­сти освещения I, т. е. квантовый выход флуоресценции не зави­сит от I. In vivo, однако, выход F/I идет к насыщению с ро­стом I (рис. 7.16) [1]. При насыщении фотосинтеза выход при-

Рис. 7.16. Зависимость вы­хода флуоресценции (в ус­ловных единицах) Porphyri - dium от интенсивности ос­вещения (в условных еди­ницах).

Таблица 7.3

Мерно удваивается. Причина этого пока не ясна [1]. Изучение спектральных свойств хлоропластов позволило локализовать фотосинтетические системы — фракционирование вещества хлоропластов и исследование спектров поглощения и флуорес­ценции двух фракций — легкой и тяжелой — показывает, что легкая фракция содержит преимущественно ФС/, а тяжелая — ФС// (табл. 7.3).

Существенные аргументы в пользу функционирования двух пигментных систем следуют из изучения флуоресценции. Одна­ко мы не располагаем пока сколько-нибудь полной интерпрета­цией флуоресценции растительных клеток in vivo.