ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ИНДУЦИРОВАННЫЙ ИОННЫЙ ТРАНСПОРТ

Очень важную информацию об ионном транспорте и устрой­стве проницаемых мембран дают исследования явлений, проис­ходящих при перемещении ионов внешними переносчиками. В § 3.3 рассмотрена общая феноменологическая теория облег­ченного транспорта, о роли переносчиков говорилось не раз.

Весьма эффективными переносчиками щелочных катионов служат депсипептиды, изучавшиеся в работах Шемякина, Овчин­никова и их сотрудников [154—157], Льва и Бужинского [158], а также Прессмана с сотрудниками [159, 160]. Депсипептиды представляют собой циклические антибиотики, построенные из чередующихся а-аминокислот и а-оксикислот. Сюда относятся валиномицин, энниатины и др. Другая группа переносчиков — монактин, нонактин и т. д. — макротетролиды, циклические со­единения, содержащие четыре эфирные и четыре сложноэфирные связи. Строение некоторых циклических переносчиков показано на рис. 3.11. Подробное описание строения и свойств переносчи­ков и мембранного транспорта ионов, происходящего с их уча­стием, содержится в фундаментальной монографии [157] (см. также обзор [161]). Теория явлений ионного транспорта, индуци­рованного переносчиками, изложена в монографии [162].

Внутренняя гидрофобная часть мембраны, обладающая ма­лой диэлектрической проницаемостью, представляет существен­ное препятствие для диффузии ионов к+ и Na+, поступающих нз водной среды. Активационный барьер, однако, резко снижает­ся, и проницаемость мембраны для таких ионов возрастает на несколько порядков в присутствии циклических переносчиков (ЦП). Молекулярная природа этих явлений состоит в том, что ЦП образуют специфические клатратные комплексы с щелоч­ными катионами, причем одна сторона ЦП гидрофильна, а дру­гая— гидрофобна. На рис. 3.12 показана структура комплекса валиномицин —К+ [156].

Действие ЦП с успехом изучается на искусственных двуслой­ных липидных мембранах (см. стр. 140). В растворе КС1 элек­трическое сопротивление такой мебраны равно по порядку вели­чины 108 Ом/см2. Проводимость мембраны линейно возрастает с концентрацией ЦП в растворе. При малом содержании К+ в растворе (менее 10-1 М) проводимость пропорциональна кон­центрации К+. Эти результаты показывают, что активным яв­ляется комплекс ЦП с одним ионом К+,

СН,

СН,

D

Н-С СН, 3\/ 3 СН

СН СН

I I 1

-0-СН-С—NH-CH -

I О

D

0

С—О—СН—С—NH—СН—С— II II II J

Валиноницин

Н»С СН, НХ СН, *\/3 3\/ 3 СН СН, СН I Г I —0-СН-С—N-CH-C-

О

Энтттин В _ СН, 0 ,

_/ \ I II / V_

0==/ у\/у\А/ \_сн5 > р. сн3 <

! \ ^ Ч

Монактин

Рис. 3.11. Химическое строение некоторых циклических переносчиков.

Способность образовывать такого рода комплексы зависит от конформационных свойств молекул ЦП. В цитированных выше работах были детально изучены различные аналоги ЦП, обладающие разной способностью к комплексообразованию. Сама эта способность есть необходимое, но недостаточное усло­вие для увеличения проницаемости мембраны. Существенно кон­кретное строение циклического соеди­нения.

Кинетическая теория транспорта ионов, облегченного переносчиками, развивалась в двух группах работ — Лейгера и сотрудников [161, 163, 164] и Маркина, Либермана и др. [162, •165—170, 184]. Обе теории приводят к сходным результатам. Рассмотрим сначала результаты, полученные в ра­ботах второй группы.

В растворе имеются ионы А (ще­лочные металлы) и жирорастворимые переносчики С, дающие комплекс АС( = Х). Вблизи билипидной мем­браны находятся неперемешиваемые слои толщиной h, в пределах которых ионы диффундируют с коэффициента­ми Dc и Dx - Частицы С и X могут пе­реходить через границу мембраны, на которой возможно и образование X. Общая схема модели представлена на рис. 3.13. Предполагается, что ионы в мембране распола­гаются в двух потенциальных ямах ширины X вблизи поверхно­стей мембраны, между которыми они совершают переходы с константами скоростей kc и kx. Проводимость мембраны вычис­ляется на основе рассмотрения кинетики перемещения ионов. Если на мембрану наложен внешний потенциал тр, то он делится между емкостями, указанными на рис. 3.13, на доли

= Ъ = + (3.127)

Afc.

• С ^—С -

К4

H h

[С] п сг

*s

Рис. 3.13. Сх&ма модели пе­реносчиков. Внизу эквива­лентная схема мембраны.

Где <7ь <72 — изменения зарядов у потенциальных ям в мембране, ц — заряд раствора электролита у левой границы мембраны. Заряды <7i, <72 связаны со сдвигом концентраций С и X от равновесных значений. Вычисляются потоки ионов и перенос­чика. Наложение потенциала % меняет константы скорости в exp(±V2Z\})j/^Bf) раз, где г —заряд иона. Определяются по­токи через границы мембраны и внутри нее, используются урав­нения диффузии для веществ С и X и условия непрерывности на
границах мембраны. Проводимость g, т. е. отношение ионного тока к гр в предельном случае малых токов, выражается весьма сложной функцией Л, С, X. Это выражение упрощается в неко­торых предельных случаях. Если А и X очень малы, то

Г2скъ Т$~С

Go = 2h/D + 2/А, + Aj/AJAC ' (3.128)

Где С — концентрация переносчика, D—его коэффициент диф­фузии, ki — константы скорости. Вольт-амперная характеристика процесса зависит от лимитирующей стадии. ЕсЛи эта стадия — диффузия в примембранных слоях, то сила тока равна

Рассмотрим противоположный случай. Пусть qu q2 <. q, так что распределение ионов в мембране не сказывается на распре­делении потенциала. Тогда

(3.130)

2z^'Ck1kc sh (>/s гф)

' k2 + '2kс ch [V2 гг|) (Ct + С2)/(С, + 2С2)] '

Где Си С2—емкости.

Напротив, если заряды q{ и q2 дают заметный вклад в рас­пределение потенциала, возможны различные случаи. Если kcСі k2C2, то благодаря высокой подвижности ионов поле внутри мембраны может экранироваться. Это произойдет, если

С1<.г2къТ9-%^-С. Тогда все напряжение падает на границах

К 2

Мембраны и делится между ними поровну. Получаем

/ = 2z9~k, С sh ("Д 2t|>). (3.131)

Если же k2C2 kcCi, то напряжение сосредоточено в мембране и

2z&~klkс sh ('/г С /== k2 + 2kc ch С/2 zi|>) ' (3,132)

Вообще говоря, вольт-амперная характеристика может зави­сеть от самых разных факторов — от неоднородности мембраны, от типа движения ионов (эстафетного или диффузионного) и т. д. Установление механизма транспорта по вольт-амперной характеристике пока невозможно.

На тех же основаниях удается рассмотреть переходный ток при фиксации напряжения на мембране [171], прохождение через мембрану переменного тока [172] и т. д.

^Рассмотрим теперь зависимость проводимости от концентра­ций А и С [165]. Допустим, что на границе мембраны обмен
ионами С и X идет медленнее, чем другие стадии. Проводимость принимает вид

__ z\kBT3Tkckx k4x So— k3Akx + k 4kc + 2kckK ■

Ионы С и X сквозь мембрану практически не проходят. Пере­носчик захватывает А на одной стороне мембраны и освобож­дает его на другой стороне. Маркин говорит о «малой кару­сели», заключенной внутри мембраны. «Большая карусель» возникает, если поверхностные ограничения реализуются не только на границах мембраны, но и в прилегающих слоях рас­твора. Если коэффициенты диффузии малы и обмен ионами А на границе мембран идет медленно, т. е. малы и то

_ zlAkbTSrklkskckxK. X

80 7 Мс (*в + 2kx) К + Мх (*2 + 2kc) Л ' (3-134)

Где К—константа ассоциации ионов А и С в комплекс X. «Большая карусель» захватывает и неподвижные слои раствора.

Ёо

Зависимость g0 от концентрации А имеет в обеих «карусе­лях» сходный характер. Так как X = ВА/(А К), где В = — С + X есть суммарная концентрация переносчика, то

РА2 + уА + б

(а, р, у, в — константы), т. е. зависимость goC<4) является кол околообразной. Максимум для «малой карусели» отвечает

[

Kkc і k. NT'/*

"vU"+2)J • (злз5)

Для «большой карусели»

к ( *I*C Vt^x VA

А

Max

• (3-136)

Действительно, для многих разобщителей окислительного фос- форилирования, играющих роль переносчиков (см. гл. 6), на­блюдается колоколообразная зависимость go (Л) в хорошем со­гласии с теорией [173, 174].

Теория объясняет наблюдаемую линейную зависимость про­водимости от концентрации переносчика.

Дальнейшие подробности, относящиеся ^ к вольт-амперным характеристикам системы и т. д., можно найти в цитированных выше работах.

Изложенная теория дает выражения для проводимости и вольт-амперные характеристики, существенным образом
зависящие от конкретных модельных предположений и содержа­щие большое число параметров. Общие закономерности вос­производятся теорией правильно и получают, тем самым, над­лежащее объяснение. Однако, в силу сказанного, теория не по­зволяет установить конкретные механизмы облегченного транс­порта [161, 163, 164].

Модель Лейгера более проста, но имеет преимущества, так как содержит меньше параметров и свободна от предположения о равновесном образовании комплекса в растворе. Модель пред­ставлена на рис. 3.14. Йа — константа скорости образования

Комплекса А-С, kr> — константа скоро­сти его распада. В более простой тео­рии удается получить выражение для проводимости и без ограничения сла­быми полями. Это выражение имеет вид

G-go-1(1 + ^)1+1chg/2)' (3-137)

2К

А«Х

А

Kv

Где go — проводимость при малом на­пряжении, и = 9~VIRT (катионы од­новалентны) и

КЛ

(3.138)

Параметр b находится из экспериментальных значений gfgo; - если g/go измеряется как функция концентрации ионов А, два члена в b определяются независимо. Значение g0 равно

G0 Nckx t, (3.139)

Где Nc— поверхностная концентрация молекул переносчика в равновесии. Таким образом, измерения проводимости дают три независимых комбинации пяти неизвестных параметров ko, kx, kc и Nc.

Рис. 3.14. Упрощенная мо­дель процессов облегченного транспорта.

Определение отдельных кинетических констант может быть осуществлено релаксационными методами ([131], гл. 7). Приме­нение релаксационных методов не ограничено гомогенными хи­мическими системами, но они могут использоваться и для кине­тического анализа мембранного транспорта [161, 164, 165]. Элек­трический релаксационный метод состоит в следующем: ячейка с двуслойной липидной мембраной соединена с источником на­пряжения и электронным включателем, позволяющим повысить силу тока менее чем за 1 мс. Ток сквозь мембрану измеряется на осциллографе как падение напряжения на внешнем сопро­тивлений Re. Немедленно после скачка напряжения наблю*
дается спайк тока, определяемый мембранной емкостью. Затем ток релаксирует к стационарному значению которому отве­чает неравенство X на двух сторонах мембраны (рис. 3.15 [161]).

Теория показывает, что ход I(t) определяется двумя време­нами релаксации хг и х2:

/ (0 = Л» (1 + <*1 еХР (- tfr\) + ехр (- t/x2)),

Причем аь а2, xi, х2 зависят от кинетических констант [161, 164]. В сочетании со стационарными параметрами проводимости эти величины позволяют опре­делить необходимые конс­танты. Такие определения были проведены для систе­мы валиномицин—К+ и мем­браны, полученной из фос - фатидилинозитола [162].

Установлено, что транс­локация свободного ЦП и комплекса через мембрану и диссипация комплекса на границе характеризуются константами скорости

5- 104 М-1 • с-1,

Kc «2 - Ю4 с-1,

FeD«5 • 104 с-1,

Kx « 2 ■ 104 с-1,

А концентрация N с состав­ляет 1,2 • 1012 молекул ва - линомицина на 1 см2, т. е. среднее расстояние между молекулами ЦП около 100 А. Транспорт происхо­дит не путем обычной диффузии, так как заряженный комплекс должен преодолеть высокий электростатический барьер внутри мембраны. Поэтому близость кинетических констант для сво­бодного переносчика и заряженного комплекса требует спе­циального объяснения.

Рис. 3.15. Схема установки для электри­ческого релаксационного метода (а), за­висимость напряжения (б) и тока (в) от времени.

М — мембрана, Re—внешнее сопротивление, О—осциллограф.

/

Константа скорости комплексообразования К+ + ЦП->Х на поверхности мембраны оценивается но порядку величины в 3-103 М-1 ■ с-1. Это на четыре порядка меньше, чем та же кон­станта в метанольном растворе, что свидетельствует о суще­ственно иных условиях на поверхности раздела мембраны и
водной фазы. Причины такого различия пока не ясны, возмож­но, что валиномицин приобретает измененную конформацию на мембране.

Можно сравнить действие молекулы переносчика с функцией фермента [164]. Фермент снижает активационный барьер реак­ции. Переносчик снижает барьер для переноса щелочного иона внутри липидной мембраны. Активность фермента характери­зуется концентрацией полунасыщения и числом оборотов. Для переносчиков концентрация полунасыщения отвечает концентра­ции ионов в водной фазе, при которой половина молекул пере­носчика, связанных в мембране, образовала комплексы. В слу­чае валиномицин — К+ эта концентрация 20 М (в метаноле 25 мМ). Таким образом, в условиях опыта концентрация связан­ного мембраной валиномицина еще далека от насыщения. Число оборотов есть максимальное число ионов К+, переноси­мых в 1 с одной молекулой валиномицина. Это число оказалось равным 104 с-1, что много больше, чем для большинства фер­ментов. Валиномицин, обладающий на поверхности мембраны малым сродством к К+, является эффективным переносчиком именно вследствие большого числа оборотов.

Изложенная теория не обязательно означает, что перенос­чики являются таковыми в истинном смысле слова. Как указы­вает Маркин [170], здесь имеются две другие возможности. Во - первых, оказываясь в среде с малой диэлектрической проницае­мостью, жирорастворимые переносчики (ионофоры) образуют агломераты [176, 177]. В этом случае возможно более сложное комплексообразование и возрастание проницаемости мембран. Реализуется коллективный транспорт [162, 170].

Вторая возможность — изменение конформационной струк­туры мембраны ионофорами и возникновение эстафетного меха­низма передачи иона от одного ионофора к другому. Цепочка ионофоров может возникать и распадаться, но эстафетный ме­ханизм, конечно, отличается от прямого переноса ионов от одной границы мембраны к другой.

Если нет прямого переноса, то изложенная теория является эффективной, а кинетические константы, найденные из опыта, — эффективными константами.

Теория коллективного транспорта ионов димерными ионофо­рами была развита Маркиным [162, 170, 178]. Есть основания считать, что по этому механизму работают многие разобщители окислительного фосфорилирования (см. гл. 6).

Эстафетный механизм исследован в теоретических работах [179—181] (см. также [162, 170]). Он, очевидно, родствен меха­низму пассивного транспорта, рассмотренному в § 3.6. Сходна и теория. Как мы видели, есть основания считать, что ионный транспорт без участия переносчиков действительно происходит по эстафетному механизму. Справедливо ли это для облегчен­ного транспорта — пока не ясно.

При коллективном и эстафетном механизмах зависимость проводимости от концентрации ионофоров не линейна (кривая g(B) выгнута), зависимость go (Л) колоколообразна, как и для «каруселей». Существенные различия для разных механизмов должны проявляться в зависимости мембранного потенциала і|)(Л), а также в зависимости высокочастотной проводимости goo (Л). До сих пор, однако, соответствующие эксперименталь­ные исследования не проведены и механизмы ионного транс­порта, облегченного переносчиками, не установлены.

Прежде чем перейти к рассмотрению генерации и распростра­нения нервного импульса, подведем некоторые итоги.

Структуре и функциям мембран посвящена колоссальная литература. Многое можно считать уже установленным и объ­ясненным, но сложность строения и поведения мембран столь велика, что трудно ожидать скорого решения всех относящихся сюда проблем. Мы располагаем феноменологической термоди­намикой мембранных процессов, рядом разумных кинетических моделей пассивного, активного и облегченного переносчиками транспорта. Развиты содержательные теоретические представ­ления о кооперативных конформационных свойствах мембран. Накоплена очень богатая и разнообразная экспериментальная информация. Тем не менее физика мембранного транспорта на­ходится на ранней стадии своего развития. Модельная теория имеет пока фрагментарный характер, не установлены внутрен­ние связи между рядом направлений исследования. Физика мембран — чрезвычайно быстро развивающаяся и весьма ак­туальная область науки. Дальнейшее ее изложение приведено в последующих главах.