ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ФОТОРЕЦЕПЦИИ

Исходя из общих принципов физики, биофизики и биологии, легко прийти к заключению, что первичный акт фоторецепции должен состоять в поглощении света молекулами некоего пиг­мента. Человек и высшие животные воспринимают свет обычной интенсивности в области примерно от 4000 до 7000 А. Ультра­фиолетовый свет поглощается прозрачными тканями глаза. Ин­фракрасные лучи не воспринимаются сетчаткой. Если бы они воспринимались, то теплокровные животные ощущали бы силь­ную фоновую инфракрасную радиацию, препятствующую рецеп­
ции информативных сигналов. Следовательно, пигмент или пиг­менты фоторецепторных клеток должны поглощать свет в види­мой области спектра, т. е. быть окрашенными. Поскольку речь идет о молекулах органических соединений, отсюда следует, что это должны быть молекулы с достаточно протяженной системой л-связей — при малом числе сопряженных связей поглощается лишь ультрафиолетовое излучение.

Действительно, еще в 1933 г. Уолд открыл присутствие ви­тамина А в зрительном пурпуре в сетчатке [107]. Структура витамина А была установлена несколько раньше [108]. Вита­мин А (точнее, витамин Ai), или ретинолі, имеет следующую структуру:

СН,

СН,

СН»

Брутто-формула ретинолаї С19Н27СН2ОН. Эта молекула пред­ставляет собой почти не измененную половину молекулы каро­тина (см. стр. 339). Каротиноиды являются источником вита­мина А, отсутствие которого приводит к слепоте.

В сетчатке позвоночных фигурирует и вторая форма вита­мина А—витамин А2, или ретинол2; структура которого отли­чается от приведенной наличием двойной связи между углеро - дами 2 и 3. Соответственно, брутто-формула ретинола2 есть С19Н25СН2ОН. Ретинолы — это спирты. В фоторецепторах рети­нолы трансформированы посредством алкогольдегидрогеназы в альдегиды — в ретинальї и ретиНаль2 — и связаны с фосфолипи - дами и белками. В ретиналях конечная группа молекулы есть не =СН—СН2ОН, а =СН—СН=0, и брутто-формулы ретиналяї и ретиналя2 суть СідН27СНО и С19Н25СНО. Число сопряженных л-связей в ретиналях на одну больше, чем в ретинолах.

Таким образом, ретинали служат хромофорными группами зрительных пигментов, содержащих липопротеины, именуемые о псинами. Опсины колбочек и палочек разнятся. Соответственно возникают четыре основных вида зрительного пигмента, охарак­теризованные в табл. 7.5 [109].

Хромофорные свойства ретиналей определяются протяжен­ной системой сопряженных л-связей. Обращает на себя внима­ние химическая общность пигментов фотосинтеза — каротинои - дов (см. стр. 340) и зрительных хромофоров. Можно думать об
общности их эволюционного происхождения. Имеются бактерии, лишенные, конечно, зрения, но содержащие бактериородопсин, весьма сходный со зрительным пигментом.

Таблица 7.5

Зрительные пигменты

Максимум поглоще­ния А,, А

Исходя из общих принципов, можно снова заключить, что вслед за поглощением света в фоторецепторе должна возникать некая фотохимическая реакция. В родопсине ретиналь образует шиффово основание в результате взаимодействия альдегидной группы ретиналя с амино-группой опсина [110, 111], а именно с е-ЫНг-группой лизила [109, 112]:

С,9Н27СН=0 + H2N—опсин —> C,9H27CH=N— опснн + Н20.

Бычнй родопсин имеет молекулярный вес около 40 000. Если счи­тать молекулу сферической, то ее диаметр составляет 40 А.

Под действием света ретиналь отщепляется от родопсина, аналогичные процессы протекают и в трех других случаях (см. табл. 7.5). Однако этим фотохимическое превращение не исчер­пывается. Одновременно происходит фотоизомеризация рети­наля.

Комплекс опсина с ретиналем возникает за счет CH = N - связи и ряда слабых взаимодействий хромофора с белком. Эти взаимодействия оптимизируются в результате структурного со­ответствия ретиналя и опсина. Ретиналь может существовать в виде ряда изомеров, так как двойная связь С = С образует транс- или і{«с-конфигурацию. Наиболее устойчива сплошная гранс-конфигурация, которая и показана для ретинолаї на стр. 380. Установлено, что в комплексе с опсином в темноте ретиналь фигурирует в форме 11 - цис [113]:

СН3 сн.

I Н I 3 Н

H2C/'VVM\h

I I " Н I

Н2С^/С(СН31г ®

С Н. С СН

Н, 6 І

"2

•НС

О

В 11-ц«£-форме СНз-группа у Ci3 и водород у Сю очень сбли­жены, и между ними возникает сильное отталкивание. Благо­даря этому молекула несколько скручена, в ней нарушено пло­ское расположение я-связей. Тем самым уменьшена энергия со­пряжения, и 11-цис-форма должна быть менее стабильной, чем полная транс-форма. Однако в комплексе с опсином проигрыш в энергии сопряжения перекрывается выигрышем в энергии взаи­модействия с белком, наибольшей для 11-цмс-формы.

При выцветании пигмента на свету ретиналь отщепляется от опсина и изомеризуется в наиболее устойчивую сплошную

Родопсин

^ Изшиерага

Fl-цас-ретиналь + алсин, g » Сплошной транс - ретинолі + онсин

К Алногалйдегифоееназа, і

Т НЛД а йр. Т

11-цис-решнол с > ' 1 к J Сплошной транс-ретинол Рис. 7.28. Цикл изомеризации родопсина.

Транс-фориу. Цикл цис—гране-изомеризации является обязатель­ной частью любой известной фоторецепторной системы [109]. Этот цикл показан на рис. 7.28 [109].

В растворе ретиналь образует под действием света смесь изо­меров, состав которой зависит от длины волны света и полярно­сти растворителя [114, 115]. Полярный растворитель — этанол — стабилизует 11-цис-конфигурацию. Ее содержание в таком рас­творе ретиналя составляет 25—30% [116].

Установлено, что единственное действие света на ретиналь состоит именно в изомеризации 1 \-цис -> сплошной транс. От­щепление ретиналя от опсина должно рассматриваться как след­ствие этого процесса [117].

В этой книге и в «Молекулярной биофизике» [12] постоянно подчеркивается определяющее значение конформационных пре­вращений молекулы в биологических явлениях.

В фоторецепции мы встречаемся не с ротамеризацией, не с конформационной перестройкой ретиналя, а с цис.—транс-изо­меризацией— повороты происходят вокруг двойных, а не еди­ничных связей. Различие между ротамеризацией и цис—транс - изомеризацией имеет количественный характер. В первом случае для конформационного превращения нужно преодолеть барьер порядка нескольких ккал/моль (в этане 3 ккал/моль), во вто­ром, при переходе 11-цис-ретиналя в полностью грамс-форму — около 25 ккал/моль, причем значение частотного предэкспонен - циального множителя составляет от 107 до 10" с-1 в зависимо­сти от растворителя [118]. Соответственно изомеры ретиналя устойчивы в растворе. Разности их энергий не велики — порядка 1—3 ккал/моль.

При возбуждении молекулы поглощенным светом происходит перестройка я-электронной оболочки, и барьер внутреннего вра­щения снижается до величины, соизмеримой с къТ. Время жизни молекулы в синглетном возбужденном состоянии 10~9 с, время, нужное для поворота, 10-11—Ю-12 с. Квантовый выход для реак­ции изомеризации 1 \-цис - у полностью транс составляет 0,5—0,7 [119]. Энергия кванта света более чем достаточна для изомери­зации— кванту с к 5000 А отвечает энергия 58 ккал/моль.

Значительный интерес представляет детальный механизм изомеризации. Нужно установить, через какое возбужденное со­стояние— синглетное или триплетное — проходит изомеризация под действием света. В теоретических работах показано, что энергетический барьер для переходов в триплетном состоянии существенно ниже, чем в синглетном [120—122]. Окончательный ответ на вопрос о роли возбужденных триплетных состояний при изомеризации хромофора в родопсине был получен в работах Розенфельда и сотрудников [123]. В этих работах был применен метод лазерного фотолиза и использована система веществ-до­норов, позволявшая в результате светового возбуждения созда­вать высокую концентрацию триплетных состояний шиффова ос­нования ретиналя. Действительно, оказалось, что эффективность изомеризации в триплетном состоянии очень высока. Однако время жизни триплетных состояний шиффова основания рети­наля практически такое же, как для триплетных состояний ре­тиналя. Это означает, что отсутствие триплетного поглощения, установленное для шиффовых оснований ретиналя [124], объяс­няется не малым временем жизни триплетов, а малой эффектив­ностью интеркомбинационной конверсии. При непосредственном фотолизе этих соединений триплеты не обнаруживаются [123].

По-видимому, триплетное состояние не играет роли при изоме­ризации хромофора в зрительном пигменте.

Действуя светом разных длин волн на раствор родопсина в эквимолярной смеси глицерина с водой при температуре—190 °С, можно обратимо смещать равновесие изомеров, что находит свое выражение в сдвигах полосы поглощения [109]. На основе такого рода исследований Уолд построил схему последовательных пре­вращений родопсина, показанную на рис. 7.29. Под действием

Рис. 7.29. Стадии выцветания родопсина.

Ретиналь заштрихован. В скобках указаны величины в А; температуры измеряются

В градусах Цельсия.

Света ретиналь, находящийся в комплексе с опсином, изомери- зуется, образуется прелюмиродопсин. При этом нарушается структурное соответствие ретиналя и опсина, и последний вместе со связанным ретиналем испытывает конформациониое превра­щение. Глобула опсина постепенно раскрывается, возникают ста­дии, обозначаемые как люмиродопсин и метародопсины. На за­ключительной стадии шиффово основание гидролизуется, и ре­тиналь отщепляется от опсина. При раскрытии опсина экспони­руются новые химические группы, в частности, две SH-группы и группа, связывающая протон, с рК около 6,6 (вероятно, имида - зольная). Эти факты установлены с помощью биохимических и физико-химических методов [125—127].

Поглощая второй квант света, ретиналь может вновь перейти в 11-цмс-форму. Пигмент не только выцветает на свету, но может и регенерироваться. Соответствующая схема представлена на рис. 7.30 [109].

Таким образом, фоторецепция сводится к изомеризации хро­мофора, за которой следует изменение структуры липопро - теида — опсина. Конформациониое превращение опсина приво­дит в конечном счете к возникновению нервного импульса.

В сетчатке головоногих моллюсков наряду с родопсином со­держится второй фоторецепторный комплекс — ретинохром. В от­личие от родопсина, ретиналь в ретинохроме находится в сплош­ной гране-форме, изомеризующейся в 11-цнс-форму при воздей­ствии оранжевым светом. Белковая часть ретинохрома может давать комплексы и с другими изомерами ретиналя. При освеще­нии все они дают 11-цис-форму, отщепляющуюся от белка. В этом смысле поведение ретинохрома противоположно поведе­нию родопсина. Можно думать, что ретинохром катализирует

PffffonniH

Рис. 7.30. Промежуточные стадии при выцветании и регенерации родопсина

Волнистые линии—действие света, прямые—темиовое превращение.

4

Опоин

Изомеризацию ретиналя и, тем самым, способствует реконструк­ции выцветшего родопсина [128].

В работе [129] было показано, что выцветание и регенерация родопсина in vitro зависят от частоты коротких вспышек лазер­ного освещения. Поглощается лишь свет, поляризация которого отвечает определенной ориентации молекул родопсина. Тем са­мым существенно соотношение между частотой вспышек и вре­менем поворота молекул родопсина в растворе.

Ценная информация об электронных переходах в ретинале получена в исследованиях флуоресценции (см., например, [130]). Изучение флуоресценции родопсина, внешних сегментов пало­чек как целостных систем и модельного соединения — N-рети- нил—опсина позволило выявить особенности переноса энергии между соседними молекулами пигмента [131]. С этими явле­ниями связан ряд интересных и важных проблем биомолекуляр­ной оптики.

Различные формы зрительных пигментов характеризуются различными спектрами поглощения. Эти' различия не сводятся к указанным в табл. 7.5. Полоса поглощения хромофора суще­ственно зависит от его взаимодействия с опсином и, следова-

Тельно, от состояния липопротеина и его видовых особенностей. Так, сетчатка лягушки содержит два типа палочек («красные» и «зеленые») и два типа колбочек. Красные палочки содержат «классический» родопсин, зеленые — родопсин с полосой погло­щения, сдвинутой в коротковолновую сторону. Спектральная чув­ствительность зрительных пигментов, как правило, коррелирует со спектральным составом света в среде, в которой существует данный организм. При переходе от голубоватой морской воды к желтоватой пресной воде родопсин в палочках рыб постепенно замещается порфиропсином. Сетчатка морских рыб имеет мак­симум чувствительности вблизи 5050 А, пресноводных — вблизи 5400 А (см. [132]).

Пигментная система фоторецепторов сходна с пигментной си­стемой фотосинтеза в том отношении, что в обоих случаях у ог­раниченного числа пигментов встречаются самые разные спект­ральные чувствительности, что объясняется разнообразием их взаимодействий с белками.

В данной главе рассматриваются лишь взаимодействие каро- тиноидов со светом, их роль в фотосинтезе и фоторецепции. Од­нако этим не исчерпывается участие каротиноидов в биологиче­ских процессах. Способность каротиноидов к цис-транс-язоыери - зации существенна для метаболизма. Наличие большого числа - ненасыщенных двойных связей определяет легкую окисляемость этих соединений и, следовательно, участие в окислительно-вос­становительных реакциях. Соответственно каротиноиды функ­ционируют в темновой биологии. Они фигурируют в ряде тканей животных, в частности, в нейронах моллюсков, в тканях вос­производящих органов как беспозвоночных, так и позвоночных (в том числе и у человека). Каротиноиды функциональны в окислительном метаболизме [133, 134]. Если биохимическая эво­люция приводит к синтезу той или иной группы органических соединений, то они используются в живой природе многообраз­но— везде, где это оптимизирует существование организма.

Факты и гипотезы, кратко изложенные в настоящем параг­рафе, ставят ряд физических задач, еще далеких от своего реше­ния. Структура опсина, а значит, и родопсина изучена недоста­точно. Поэтому пока невозможно построение детализированной модели родопсина и его превращений на свету. Значительный интерес представила бы квантовая химия этих явлений, еще не построенная.

Наибольший интерес представляет установление связи ме­жду событиями, происходящими в родопсине, и возникновением электрических потенциалов в последовательных нейронах сет­чатки, завершающееся посылкой нервного импульса в мозг. Об этом почти ничего не известно. Далее необходимо изучить строе­ние и свойства мембран фоторецепторных клеток. Очевидно, что без такого рассмотрения нельзя даже подойти к решению ука­занных вопросов. Дальнейшие подробности, относящиеся к фо­торецепции на молекулярном уровне, см. в [109, 135].

Для понимания молекулярного механизма фоторецепции су­щественны исследования кинетики темновых реакций зритель­ного пигмента, протекающих вслед за световым воздействием. Согласно Абрахамсону [136], целесообразно разделять эти реак­ции на ранние и поздние стадии. К первым относятся переходы прелюмиродопсин люмиродопсин метародопсин I —* метаро - допсин II. Они происходят быстро, как установлено с помощью импульсного фотолиза (см. [137—139]). Предполагается, что по­следний переход, сопровождаемый конформационными измене­ниями, и приводит к изменению проницаемости фоторецептор - ной мембраны и к генерации импульса. Это удалось подтвердить экспериментально [140]. Процессы второй стадии, следующие за указанными, по-видимому, не имеют отношения к формированию первичного электрического ответа фоторецептора и, возможно, играют роль в регенерации родопсина [141]. Они происходят очень медленно (секунды и даже минуты) и характеризуются простой кинетикой. Напротив, кинетика перехода метародо­псин I—*■ метародопсин II, изученная методом импульсного фотолиза, сложна, она аппроксимируется суммой не менее, чем трех экспонент [142]. То же относится к реакциям прелюмиродо­псин —»люмиродопсин [143] и люмиродопсин метародопсин I [142]. Были опубликованы и другие данные. В наиболее подроб­ном исследовании перехода прелюмиродопсин -> люмиродопсин, проведенном методом импульсного фотолиза в средах с различ­ной вязкостью, установлено, что кинетика перехода аппроксими­руется суммой трех экспонент, т, е. процесс является суммой параллельных реакций первого порядка. Константы скоростей перехода не зависят от вязкости [143, 144]. Есть основания ду­мать, что сложная кинетика является универсальным свойством ранних темновых реакций как in vitro, так и in vivo [145]. При­чины сложной кинетики и ее биологическая значимость остаются пока неясными.