ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

МЕМБРАНЫ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ

Как уже сказано, фоторецепторные клетки содержат стопки ламелл или дисков — мембран, в которых и локализованы зри­тельные пигменты. Число таких дисков в одной клетке велико, оно достигает 500—1000. Мембраны содержат обычный били - пидный слой, что доказывается методами рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии и др. [146]. Установлено, что молекулы родопсина лежат на внутренней гидрофильной по­верхности мембраны [147].

Фоторецепторные мембраны внешних сегментов палочек быка и лягушки содержат около 60% белка и 40% липидов. Ро­допсин является главной фракцией белка, составляя до 80% от его общего содержания. Липиды представлены главным образом фосфолипидами — фосфотидилэтаноламином, фосфотидилхоли - ном и фосфотидилсерином, присутствует и 5—10% гликолипида.

Предложены различные модели устройства фоторецепторной мембраны, на которых мы не будем останавливаться (см. [146, 148—150]). Эти модели не всегда согласуются друг с другом.

Диски внешних сегментов палочек представляют собой сво­бодно плавающие внутриклеточные органеллы, подобные мито­хондриям. Мембрана диска охватывает определенное простран­ство, отделяемое полупроницаемой мембраной от внутриклеточ­ного пространства фоторецептора, в котором «взвешены» диски. Мембрана непроницаема для Na+, К+, Са++, Mg++, СІ" и РОГ". In vitro в ответ на изменения осмотического давления окру­жающей среды изолированные диски набухают и сжимаются [151].

Наиболее интересна проблема влияния освещения на мем­брану в целом. В результате освещения мембрана становится более проницаемой — она не удерживает все растворенное ве­щество столь же эффективно, как мембрана, адаптированная к темноте [151]. Конформационное изменение родопсина приво­дит к изменению состояния мембраны, к увеличению пассивной проницаемости ионов Na и К+.

Методами рентгенографии и электронной микроскопии уста­новлено, что в мембране диска при освещении происходят опре­деленные структурные изменения, масштаб которых пропорцио­нален времени экспозиции. Суть этих изменений состоит в транс­локации родопсина. В результате освещения родопсин перехо­дит с междисковой гидрофильной поверхности во внутреннюю гидрофобную фазу мембраны [152]. Такого рода транслокации имеют характер фазовых переходов. Фазовые переходы в мем­бранах фоторецепторных клеток лягушки и кальмара были обнаружены и изучены методом дифференциальной калоримет­рии [153].

Общий обзор строения и свойств фоторецепторных мембран дан Деменом [154].

С помощью электронного парамагнитного резонанса было проведено исследование фоторецепторной мембраны с введен­ным в нее спиновым зондом — бирадикалом

RO(CH3)jSi—О—Si(CH3)2OR,

Где R есть иминоксильный радикал

СНзу /СН3

;n—о

НзС/ ^СН3

При освещении суспензии мембран наблюдаются значительные изменения спектров ЭПР, указывающие на увеличение времени вращательной диффузии бирадикала в мембране т. Форма кри­вой зависимости т от длительности освещения свидетельствует о том, что фотолиз пигмента сопряжен с изменением конформа- ционного состояния мембраны, с увеличением микровязкости ее гидрофобных областей. Эти результаты можно считать прямым доказательством конформационных превращений мембраны при освещении [155].

К сходным выводам приводит изучение фоторецепторных мембран методом ^"Резонансной спектроскопии (эффект Мёсс - бауэра). В качестве метки применялся аскорбат железа, обога­щенный изотопом Fe57, источником ^"излУчения служил Со57 [156].

Особый интерес представляет АТФ-азная ферментативная активность, присущая фоторецепторной мембране. Еще в 30-х годах Энгельгардт высказал предположение об использовании энергии АТФ в первичном процессе зрения. Это предположение было косвенно подтверждено Венкстерн в исследовании АТФ - азной активности сетчатки [157, 158]. В дальнейшем была уста­новлена локализация АТФ-азной активности в мембранах на­ружного сегмента фоторецепторов. АТФ-аза является Mg-акти - вируемой, она связана с родопсином [159]. Фотолиз зритель­ного пигмента in vitro приводит к заметному ингибированию АТФ-азы, что, надо думать, обусловлено внутримолекулярной перестройкой пигмента, подвергающегося фотоденатурации на последних стадиях фотолиза. Не исключено, что на более ран­них стадиях ферментативная активность увеличивается, как предполагал Уолд [160].

Можно думать, что АТФ-азная активность необходима при фоторецепции для усиления полученного фоторецепторной клет­кой сигнала за счет энергии АТФ. Человеческий глаз, как уже сказано, обладает высокой чувствительностью к свету — он спо­собен регистрировать несколько фотонов.^ Палочка может быть стимулирована одним фотоном с энергией порядка 4-Ю-12 эрг (при Л 5000 А). Согласно основному закону фотохимии Эйн­штейна, один фотон может вызвать перестройку одной лишь молекулы родопсина из 109 молекул, содержащихся в палочке. Светочувствительность палочки максимальна.

Однако энергия одного кванта недостаточна для физиологи­ческой стимуляции рецепторной клетки. Расчеты показывают, что для этого нужно усиление в несколько тысяч раз. Предполо­жительно усиление имеет биохимический характер и происходит в результате ферментативного гидролиза АТФ. Механизм этого гипотетического процесса пока совершенно загадочен.

Именно на фоторецепторных мембранах лучше всего изу­чены жидкостные (жидко-кристаллические) свойства мембран (ср. § 3.8). Это оказалось возможным потому, что в фоторецеп­торных мембранах функционирует практически один лишь бе­лок— родопсин, — за которым легко следить.

Уже давно было установлено, что палочки, адаптированные к темноте, обладают дихроизмом. Свет, поляризованный перпен­дикулярно к длинной оси палочки, поглощается в несколько раз сильнее, чем свет, поляризованный параллельно этой оси. Сле­довательно, хромофор родопсина ориентирован параллельно плоскости мембраны диска. Однако на этой плоскости хромо­форы ориентированы беспорядочно и соответствующего ди­хроизма нет [161, 162]. Можно фотоиндуцировать дихроизм, про­водя частичное выцветание родопсина с помощью плоскополя - ризованного света. В обычных условиях дихроизм не возникает, что объясняется броуновским вращательным движением моле­кул родопсина в сетчатке [163]. Однако при обработке сетчатки глутаровым альдегидом наблюдается очень сильный фотоинду - цированный дихроизм [164]. Глутаровый альдегид образует сшивки, препятствующие вращению молекул родопсина. Другие возможные объяснения отсутствия фотодихроизма в нормаль­ной сетчатке исключены экспериментально. Перенос энергии между молекулами родопсина, среднее расстояние между кото­рыми составляет около 70 А [165], невозможен. Работа [164] до­казывает вращательную подвижность родопсина в сетчатке. О том же свидетельствует изучение фотодихроизма при импульс­ном фотолизе [166]. При импульсном освещении происходит скачкообразное возрастание поглощения, определяемое превра­щением родопсина в прелюмиродопсин. Это возрастание значи­тельно больше, если векторы поляризации действующего света и света, поглощение которого измеряется, параллельны, чем в том случае, когда оба вектора перпендикулярны друг к другу. Вспышка индуцирует дихроизм, который быстро исчезает. По­ловинное время исчезновения дихроизма при 20 °С составляет 3,0 ±1,5 мкс. С увеличением температуры этот процесс уско­ряется. Увеличение вязкости среды замедляет исчезновение фо­тодихроизма.

Если зависимость дихроизма от времени действительно опре­деляется вращательной диффузией, то справедливо уравнение

Д2п дп,7 . „>

<?02 ~х at '

Где п — доля хромофоров, ориентированных в интервале углов от 6 до 6 + dQ, х — время релаксации. Для линейного хромо - форма и вращательной диффузии вокруг оси, перпендикулярной к мембране диска, решение (7.12) имеет вид

И = 1 + / ехр (— 4//т) cos 26. (7.13)

Время t измеряется от начала вспышки, 6 — угол, образуемый хромофором с электрическим вектором вспышечного света, / ^ 1 — эмпирический множитель. Дихроичное отношение равно

Л/2

^ п (0) cos2 9 dB

І... 2 + f ехр (- 4//т)

(7.14)

F 2 - / ехр (- 4t/x)

\ n (0) sin2 0 dB 0

В идеальных условиях, когда / = 1, максимальное начальное отношение равно 3, что отвечает значению, найденному для сет­чатки, фиксированной глутаровым альдегидом [164]. В импульс­ных опытах это отношение получалось равным 2, что отвечает f = 0,7. Значение времени вращательной диффузии т зависит от вязкости среды г), ее температуры, а также от размеров хро­мофорной молекулы. Согласно Эйнштейну, для сферы радиуса г, испытывающей броуновское вращение вокруг некоторой оси,

8яг3 .

Т = 1^ГТ1- (7Л5>

При 20 °С т для родопсина имеет значение около 20 мкс, г = = 22—28 А, родопсин приближенно сферичен и погружен в мем­брану. Отсюда следует, что вязкость мембраны г) около 2 пуаз (интервал от 0,7 до 6 пуаз), т. е. она близка к вязкости легкого масла (такого, как оливковое). Мембрана оказывается весьма жидкой. Это согласуется с другими данными о подвижности мембран, например, с результатами изучения поступательной диффузии флуоресцирующих антител, присоединенных к анти­генам на поверхностях некоторых клеток [167]. В этих случаях также получились значения г) порядка 1—10 пуаз (ср. § 3.8).

В той же работе Кона [166] обсуждается вопрос о функцио­нировании родопсина в качестве диффузионного переносчика. По-видимому, при поворотах молекулы родопсина, возникающих вследствие его конформационных превращений, меняется сте­пень погружения родопсина в жидкую билипидную мембрану, что существенно для изменения ее ионной проницаемости (см. [168]).

Позднее удалось наблюдать и латеральную диффузию ро­допсина в мембране [169]. Измерения проводились в выделен­ных палочках методом импульсного фотолиза и микроспектро - фотометрии. Изучалось перераспределение выцветшего и невы­цветшего родопсина. Найденная константа диффузии D для палочек из сетчатки лягушки равна 3,5 ± 1,5• 10—9 см2-с-1. Вязкость мембраны, вычисляемая по формуле

KpT

4=6Щг - <7-16>

Оказалась лежащей в том же интервале значений 1—4 пуаз. Время между столкновениями соседних молекул родопсина в сетчатке находится по формуле

S2 = 4 Dxe, (7.17)

Где s — расстояние между молекулами родопсина. Если эффек­тивный диаметр молекулы родопсина 45 А, а расстояние между центрами молекул 70 А, то s = 25 А и тс = 4 мкс, что в 5 раз меньше времени релаксации вращательной диффузии. Частота соударений составляет 105 — 106 с-1.

Эти результаты представляют большой интерес. Они дают основу для построения теории функционирования мембран, исхо­дящей из их жидкостных свойств (ср. стр. 142). Мы еще очень мало знаем о событиях, приводящих к возникновению нервного импульса в фоторецепторной системе. Можно думать, что эти события тесно связаны с поведением жидкой мембраны.