МЕМБРАНЫ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ
Как уже сказано, фоторецепторные клетки содержат стопки ламелл или дисков — мембран, в которых и локализованы зрительные пигменты. Число таких дисков в одной клетке велико, оно достигает 500—1000. Мембраны содержат обычный били - пидный слой, что доказывается методами рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии и др. [146]. Установлено, что молекулы родопсина лежат на внутренней гидрофильной поверхности мембраны [147].
Фоторецепторные мембраны внешних сегментов палочек быка и лягушки содержат около 60% белка и 40% липидов. Родопсин является главной фракцией белка, составляя до 80% от его общего содержания. Липиды представлены главным образом фосфолипидами — фосфотидилэтаноламином, фосфотидилхоли - ном и фосфотидилсерином, присутствует и 5—10% гликолипида.
Предложены различные модели устройства фоторецепторной мембраны, на которых мы не будем останавливаться (см. [146, 148—150]). Эти модели не всегда согласуются друг с другом.
Диски внешних сегментов палочек представляют собой свободно плавающие внутриклеточные органеллы, подобные митохондриям. Мембрана диска охватывает определенное пространство, отделяемое полупроницаемой мембраной от внутриклеточного пространства фоторецептора, в котором «взвешены» диски. Мембрана непроницаема для Na+, К+, Са++, Mg++, СІ" и РОГ". In vitro в ответ на изменения осмотического давления окружающей среды изолированные диски набухают и сжимаются [151].
Наиболее интересна проблема влияния освещения на мембрану в целом. В результате освещения мембрана становится более проницаемой — она не удерживает все растворенное вещество столь же эффективно, как мембрана, адаптированная к темноте [151]. Конформационное изменение родопсина приводит к изменению состояния мембраны, к увеличению пассивной проницаемости ионов Na и К+.
Методами рентгенографии и электронной микроскопии установлено, что в мембране диска при освещении происходят определенные структурные изменения, масштаб которых пропорционален времени экспозиции. Суть этих изменений состоит в транслокации родопсина. В результате освещения родопсин переходит с междисковой гидрофильной поверхности во внутреннюю гидрофобную фазу мембраны [152]. Такого рода транслокации имеют характер фазовых переходов. Фазовые переходы в мембранах фоторецепторных клеток лягушки и кальмара были обнаружены и изучены методом дифференциальной калориметрии [153].
Общий обзор строения и свойств фоторецепторных мембран дан Деменом [154].
С помощью электронного парамагнитного резонанса было проведено исследование фоторецепторной мембраны с введенным в нее спиновым зондом — бирадикалом
RO(CH3)jSi—О—Si(CH3)2OR,
Где R есть иминоксильный радикал
СНзу /СН3
;n—о
НзС/ ^СН3
При освещении суспензии мембран наблюдаются значительные изменения спектров ЭПР, указывающие на увеличение времени вращательной диффузии бирадикала в мембране т. Форма кривой зависимости т от длительности освещения свидетельствует о том, что фотолиз пигмента сопряжен с изменением конформа- ционного состояния мембраны, с увеличением микровязкости ее гидрофобных областей. Эти результаты можно считать прямым доказательством конформационных превращений мембраны при освещении [155].
К сходным выводам приводит изучение фоторецепторных мембран методом ^"Резонансной спектроскопии (эффект Мёсс - бауэра). В качестве метки применялся аскорбат железа, обогащенный изотопом Fe57, источником ^"излУчения служил Со57 [156].
Особый интерес представляет АТФ-азная ферментативная активность, присущая фоторецепторной мембране. Еще в 30-х годах Энгельгардт высказал предположение об использовании энергии АТФ в первичном процессе зрения. Это предположение было косвенно подтверждено Венкстерн в исследовании АТФ - азной активности сетчатки [157, 158]. В дальнейшем была установлена локализация АТФ-азной активности в мембранах наружного сегмента фоторецепторов. АТФ-аза является Mg-акти - вируемой, она связана с родопсином [159]. Фотолиз зрительного пигмента in vitro приводит к заметному ингибированию АТФ-азы, что, надо думать, обусловлено внутримолекулярной перестройкой пигмента, подвергающегося фотоденатурации на последних стадиях фотолиза. Не исключено, что на более ранних стадиях ферментативная активность увеличивается, как предполагал Уолд [160].
Можно думать, что АТФ-азная активность необходима при фоторецепции для усиления полученного фоторецепторной клеткой сигнала за счет энергии АТФ. Человеческий глаз, как уже сказано, обладает высокой чувствительностью к свету — он способен регистрировать несколько фотонов.^ Палочка может быть стимулирована одним фотоном с энергией порядка 4-Ю-12 эрг (при Л 5000 А). Согласно основному закону фотохимии Эйнштейна, один фотон может вызвать перестройку одной лишь молекулы родопсина из 109 молекул, содержащихся в палочке. Светочувствительность палочки максимальна.
Однако энергия одного кванта недостаточна для физиологической стимуляции рецепторной клетки. Расчеты показывают, что для этого нужно усиление в несколько тысяч раз. Предположительно усиление имеет биохимический характер и происходит в результате ферментативного гидролиза АТФ. Механизм этого гипотетического процесса пока совершенно загадочен.
Именно на фоторецепторных мембранах лучше всего изучены жидкостные (жидко-кристаллические) свойства мембран (ср. § 3.8). Это оказалось возможным потому, что в фоторецепторных мембранах функционирует практически один лишь белок— родопсин, — за которым легко следить.
Уже давно было установлено, что палочки, адаптированные к темноте, обладают дихроизмом. Свет, поляризованный перпендикулярно к длинной оси палочки, поглощается в несколько раз сильнее, чем свет, поляризованный параллельно этой оси. Следовательно, хромофор родопсина ориентирован параллельно плоскости мембраны диска. Однако на этой плоскости хромофоры ориентированы беспорядочно и соответствующего дихроизма нет [161, 162]. Можно фотоиндуцировать дихроизм, проводя частичное выцветание родопсина с помощью плоскополя - ризованного света. В обычных условиях дихроизм не возникает, что объясняется броуновским вращательным движением молекул родопсина в сетчатке [163]. Однако при обработке сетчатки глутаровым альдегидом наблюдается очень сильный фотоинду - цированный дихроизм [164]. Глутаровый альдегид образует сшивки, препятствующие вращению молекул родопсина. Другие возможные объяснения отсутствия фотодихроизма в нормальной сетчатке исключены экспериментально. Перенос энергии между молекулами родопсина, среднее расстояние между которыми составляет около 70 А [165], невозможен. Работа [164] доказывает вращательную подвижность родопсина в сетчатке. О том же свидетельствует изучение фотодихроизма при импульсном фотолизе [166]. При импульсном освещении происходит скачкообразное возрастание поглощения, определяемое превращением родопсина в прелюмиродопсин. Это возрастание значительно больше, если векторы поляризации действующего света и света, поглощение которого измеряется, параллельны, чем в том случае, когда оба вектора перпендикулярны друг к другу. Вспышка индуцирует дихроизм, который быстро исчезает. Половинное время исчезновения дихроизма при 20 °С составляет 3,0 ±1,5 мкс. С увеличением температуры этот процесс ускоряется. Увеличение вязкости среды замедляет исчезновение фотодихроизма.
Если зависимость дихроизма от времени действительно определяется вращательной диффузией, то справедливо уравнение
Д2п дп,7 . „>
<?02 ~х at '
Где п — доля хромофоров, ориентированных в интервале углов от 6 до 6 + dQ, х — время релаксации. Для линейного хромо - форма и вращательной диффузии вокруг оси, перпендикулярной к мембране диска, решение (7.12) имеет вид
И = 1 + / ехр (— 4//т) cos 26. (7.13)
Время t измеряется от начала вспышки, 6 — угол, образуемый хромофором с электрическим вектором вспышечного света, / ^ 1 — эмпирический множитель. Дихроичное отношение равно
Л/2
^ п (0) cos2 9 dB
І... 2 + f ехр (- 4//т)
F 2 - / ехр (- 4t/x)
\ n (0) sin2 0 dB 0
В идеальных условиях, когда / = 1, максимальное начальное отношение равно 3, что отвечает значению, найденному для сетчатки, фиксированной глутаровым альдегидом [164]. В импульсных опытах это отношение получалось равным 2, что отвечает f = 0,7. Значение времени вращательной диффузии т зависит от вязкости среды г), ее температуры, а также от размеров хромофорной молекулы. Согласно Эйнштейну, для сферы радиуса г, испытывающей броуновское вращение вокруг некоторой оси,
8яг3 .
Т = 1^ГТ1- (7Л5>
При 20 °С т для родопсина имеет значение около 20 мкс, г = = 22—28 А, родопсин приближенно сферичен и погружен в мембрану. Отсюда следует, что вязкость мембраны г) около 2 пуаз (интервал от 0,7 до 6 пуаз), т. е. она близка к вязкости легкого масла (такого, как оливковое). Мембрана оказывается весьма жидкой. Это согласуется с другими данными о подвижности мембран, например, с результатами изучения поступательной диффузии флуоресцирующих антител, присоединенных к антигенам на поверхностях некоторых клеток [167]. В этих случаях также получились значения г) порядка 1—10 пуаз (ср. § 3.8).
В той же работе Кона [166] обсуждается вопрос о функционировании родопсина в качестве диффузионного переносчика. По-видимому, при поворотах молекулы родопсина, возникающих вследствие его конформационных превращений, меняется степень погружения родопсина в жидкую билипидную мембрану, что существенно для изменения ее ионной проницаемости (см. [168]).
Позднее удалось наблюдать и латеральную диффузию родопсина в мембране [169]. Измерения проводились в выделенных палочках методом импульсного фотолиза и микроспектро - фотометрии. Изучалось перераспределение выцветшего и невыцветшего родопсина. Найденная константа диффузии D для палочек из сетчатки лягушки равна 3,5 ± 1,5• 10—9 см2-с-1. Вязкость мембраны, вычисляемая по формуле
KpT
4=6Щг - <7-16>
Оказалась лежащей в том же интервале значений 1—4 пуаз. Время между столкновениями соседних молекул родопсина в сетчатке находится по формуле
S2 = 4 Dxe, (7.17)
Где s — расстояние между молекулами родопсина. Если эффективный диаметр молекулы родопсина 45 А, а расстояние между центрами молекул 70 А, то s = 25 А и тс = 4 мкс, что в 5 раз меньше времени релаксации вращательной диффузии. Частота соударений составляет 105 — 106 с-1.
Эти результаты представляют большой интерес. Они дают основу для построения теории функционирования мембран, исходящей из их жидкостных свойств (ср. стр. 142). Мы еще очень мало знаем о событиях, приводящих к возникновению нервного импульса в фоторецепторной системе. Можно думать, что эти события тесно связаны с поведением жидкой мембраны.