ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ ФОТОСИНТЕЗА

Основными продуктами двух первичных фотохимических ре­акций являются восстановленное промежуточное соединение ХН и окисленное Z (см. рис. 7.1). Окислитель Z окисляет Н20 до 02, ХН восстанавливает С02 до углевода. Процессы эти про­текают с участием ферментов. Ферментативная система, уча­ствующая в выделении 02, содержит марганец. Установлено, что ион марганца участвует в реакции, фотокатализируемой ФС// (см. табл. 7.3). Пара Мп3+/Мп2+ характеризуется высо­ким окислительно-восстановительным потенциалом (около 1,5 В). Можно предположить, что Мп2-Н испытывает фотоокис­ление до Мп3+ во второй световой реакции, а затем Мп3+ окис­ляет воду в темновой реакции:

2Мп3+ + Н20 —* 1/2О2 + 2Мп2+ + 2Н+

Для чего нужно более чем +0,75эВ. Конечно, речь здесь идет о Мп как кофакторе фермента.

Таким образом, предположительно Z есть фермент, содер­жащий трехвалентный марганец. Предполагалось, что X это НАДФ+ (пара НАДФ+/НАДФ-Н имеет потенциал —0,35 В). В действительности имеется не менее чем два предшественни­ка— железосодержащий белок ферредоксин ФД и фермент ферредоксин-НАДФ-редуктаза. Установлено, что освещенные хлоропласты восстанавливают пигмент вплоть до —0,6 В [44]. Предположительно потенциал X близок к этой величине. Схема возможных реакций [1] записывается в виде

X ФД ФД-НАДФ - ^ НАДФ+

ХН Восст. ФД * редуктаза НАДФ-Н '

—0,6В -0,4В —0,35В

Гораздо лучше известен химический путь, ведущий от С02 (вос­станавливаемого такими веществами, как НАДФ-Н) к углеводу.

Этот путь был установлен Кальвином и его сотрудниками, широко использовавшими радиоактивную метку — углерод С14 [54—56].

Стехиометрическое уравнение, описывающее брутто-реак - цию фиксации двуокиси углерода, имеет вид

6 РДФ + 6 С02 + 18 АТФ + 12 НАДФ-Н —►

—>6 РДФ + ГФ +18 АДФ + 17 Ф„ + 12 НАДФ.

Здесь РДФ — рибозо-1,5-дифосфат

О ОН ОН

II I 1

(Р)ОСН2—С—С— С—СН20(Р),

Н н

ГФ — гексозофосфат. РДФ является первичным акцептором С02. Путь углерода в фотосинтезе — последовательности тем - новых реакций — описывается так называемым циклом Каль­вина— Бассама. Этот цикл состоит из 13 стадий, катализируе­мых соответствующими ферментами (см. [55]). Суммарная ре­акция написана выше. В сокращенных обозначениях

6С5 + 6С, =6С5 + С6, где индексы обозначают число атомов углерода в соединении.

Ацф+фн атф

Рис. 7.17. Упрощенная схема цикла превращений углерода по Кальвину.

Упрощенная схема цикла Кальвина показана на рис. 7.17, бо­лее детализированная его схема — на рис. 7.18. Результирую­щий гексозофосфат гидролизуется с отщеплением фосфата. На образование одной молекулы гексозы из 6 молекул С02 расхо­дуется энергия 18 молекул АТФ. Именно эти молекулы обра­зуются при переносе электронов в процессе фотосинтеза —
происходит фотофосфорилирование АДФ. Суммарная реакция имеет вид

НАДФ + «'АДФ + п'Ф„ + пПа> —>- НАДФ-Н + «'АТФ + 02 + («' — 2) Н20.

Эта реакция реализуется в полной системе с участием пигмент­ных систем и цепи переноса электронов. Главные физические

J СО,

ЖЧ ЖЧ.

П

ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК

Вт

■ В НАДФ-Н

ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА

♦

І

J АТФ

Лсилулозв-

РиВулозофосфат ■ РиВулозофосфат РиВулвзвфвсфат

В НАДФ ■

А

<Дшкси - ицетв//-

Рис. 7.18. Путь углерода в фотосинтезе. ФГК—3-фосфоглицерат, ФГА—глицеральдегид-3-фосфат.

Проблемы фотосинтеза относятся к механизму фотофосфорили- рования, т. е. превращения световой энергии в химическую энергию макроэрга. Эти проблемы рассматриваются в следую­щих двух параграфах.

§ 7.6. ХЛОРОПЛАСТЫ

Как уже сказано, фотосинтез происходит в органоидах ра­стительных клеток, именуемых хлоропластами. На рис. 7.19 приведена электронная микрофотография среза хлоропласта из листа кукурузы [57]. Хлоропласты имеют диаметры, варьирую­щие от 3 до 10 мкм, и толщину от 1,5 до 3 мкм. Таким обра­зом, хлоропласт заполняет почти всю клетку зеленой водоросли. На рис. 7.19 в хлоропласте видны примерно параллельные ла - меллы, погруженные в более светлую строму. У высших расте­ний ламеллы плотно упакованы параллельно друг другу и образуют стопки, называемые гранами. Ламеллы представляют собой сечения уплощенных замкнутых мешочков — тилакоидов, имеющих диаметр около 5000 А. Число тилакоидов в хлоропла­сте порядка 1000. Модель структуры хлоропласта, предложен­ная Вейером [58], показана на рис. 7.20 [57]. Мембрана тила - коида имеет толщину около 100 А-

Ряд фактов показывает, что все процессы фотосинтеза ло­кализованы в тилакоидных мембранах. Именно в них содер­жатся активные пигменты, прежде всего хлорофилл. Фрагмен­ты тилакоидов реализуют реакцию Хилла и фотофосфорили - рование.

Из фактов, изложенных выше, следует, что молекулы хлоро­филла в хлоропластах действуют независимо друг от друга, но

Рис. 7.19. Электронная микрофотография среза хлоропласта.

•і1".

Согласованно, что обусловливается, по-видимому, наличием определенных функциональных единиц, локализованных в ти - лакоидах. Установлено, что некоторая доля молекул Chi а, по­глощающих свет вблизи 7000 А, ориентирована в хлоропласте определенным образом. Об этом свидетельствуют измерения ди­хроизма [59, 60]. Цитохром f, по-видимому, расположен близко к этим ориентированным молекулам хлорофилла. При освеще­нии зеленых листьев поглощение в цитохроме f при 5530 А уменьшается, т. е. он окисляется. Это происходит и при низких температурах. Одновременно наблюдаются и изменения в спектре Chi а. Отметим, что при низких температурах затруд­нен транспорт электрона на большие расстояния. Отсюда мо­жно заключить, что цитохром f каким-то образом ассоциирован с Chi а или с Р 700 [57, 61] (см. также § 7.7),

Как указывалось выше, фотосинтез происходит в двух фо­тохимических системах. Проблема пространственной локализа­ции этих систем в хлоропластах очень актуальна.

При деструкции хлоропластов ультразвуком было установ­лено, что частицы с константой седиментации 38S, имеющие диаметр порядка 300 А, сохраняют способность к реакции Хил­ла [62]. Частицы объемом менее 15 • 105 А3 уже не активны [63]. Отсюда следует, что наи­меньшее число молекул хло­рофилла, активных в фото­синтезе, равно 40—120 [57].

При освещении хлоро­пластов или целостных фо- тосинтезирующих организ­мов (водорослей) наблюда­ются два сигнала ЭПР. Пер­вый сигнал (R) представ­ляет собой резкий пик, бы­стро возникающий и быстро исчезающий. Второй сигнал (S)—широкий, медленно возрастающий и еще мед­леннее исчезающий. /?-сиг - нал приписывается Chi а и, возможно, Р700, т. е. ФС/, S-сигнал — ФС // [64]. /?-си - гнал генерируется наимень­шими частицами, получаю­щимися при разрушении хлоропластов, напротив, S-сигнал исчезает уже тов [65].

Опыты по сегментации хлоропластов показывают, что фото­синтетическая активность действительно присуща отдельным тилакоидам (см. [57, 66]). Более точная локализация пигмент­ных систем пока не установлена. Для этого нужно было бы провести опыты по реконструкции фотосинтетической системы из неактивных фрагментов.

Рис. 7.20. Модель структуры хлоро­пласта.

Гораздо больших фрагмен-

Структурные исследования тилакоидов методом электронной микроскопии показывают, что тилакоиды содержат регулярные, кристаллоподобные системы плотно упакованных гранул [66, 67]. На рис. 7.21 показана электронная микрофотография среза тилакоида из листа шпината. На ней хорошо видны гранулы, размером 185 X 155 X ЮОА3. На некоторых микрофотографиях удается увидеть, что эти частицы в свою очередь построены из четырех или большего числа субъединиц. Молекулярный вес
гранулы оценивается в 2 • 106. Зная состав ламелл, можно, ис­ходя из этой оценки, определить число молекул различных ве­ществ в грануле. Соответствующие данные приведены в табл. 7.4 [67].

Число молекул хлорофилла, равное 230, находится в разум­ном согласии с независимой оценкой для фотосинтетической единицы (см. стр. 337).

Рис. 7.21. Электронная микрофотография среза тилакоида.

Значение этих гранул снижается тем обстоятельством, что их упаковка варьирует в зависимости от условий роста расте­ния. Частицы, обладающие размерами, близкими к указанным, способны реализовать реакцию Хилла, но не полный фотосин­тез, даже если к ним добавлены растворимые компоненты хло­ропластов [57].

Рассеяние рентгеновых лучей под малыми углами дает ин­формацию о размерах ламелл [69]. Каждый тилакоид состоит из корпускулярного слоя, построенного из частиц диаметром 31—36 А. Внутри слоя находится непрерывный элемент толщи­ною в 42 А. Общая толщина тилакоида, состоящего из замкну­того корпускулярного слоя, окружающего замкнутый же двой­ной непрерывный слой, равна 178А. Корпускулы диаметром

Таблица 7.4

Состав гранулы из тилакоида шпината

31 А соответствуют! Д гранулы. Таким образом, результаты ис­следования рассеяния рентгеновых лучей в какой-то мере со­гласуется с построением гранул из субъединиц. Однако нет пол­ного соответствия между ■ данными электронной микроскопии и результатами изучения рассеяния рентгеновых лучей.

Два факта заслуживают особенного внимания — кристалло- подобная структура, показанная на рис. 7.20, и отсутствие пол­ной фотосинтетической активности у частиц, имеющих размеры гранул. Возможно, что для такой активности необходим именно упорядоченный коллектив гранул, достаточно большой «кри­сталл». Высокая упорядоченность и периодичность структуры, не наблюдаемая в других мембранах, заставляет думать о воз­можности применения представлений физики твердого тела к механизму фотосинтеза (см. § 7.7). Это пока лишь гипотетиче­ские соображения. Вместе с тем, нельзя считать исключенными артефакты, создаваемые оттенением посредством 0s04 или КМп04, применяемым в электронной микроскопии [69] (ср. стр. 290).

(7.8)

Обработка детергентами (дигитонином) с последующим цен­трифугированием и электрофорезом позволяет определить со­держание и состав белков в хлоропластах [171, 172]. Более детальная информация о расположении и ориентации белко­вых молкул в мембранах получена иммунологическими и другими методами. Установлено, что в хлоропластах имеются ча­стицы двух сортов: легкие диаметром 70—110 А и тяжелые диа­метром 150—180 А. Легкие частицы содержат больше Chi а, они способны к циклическому фосфорилированию и к восстановле­нию НАДФ+ в присутствии аскорбата [173]. Тяжелые частицы содержат больше Chi b, они способны восстанавливать на свету феррицианид (реакция Хилла) и проводить нециклическое фос­форилирование. На этих основаниях легкие частицы отождеств­ляются с ФС/, тяжелые — с ФС//. На квадратном микрометре поверхности тилакоида содержится около 4000 легких частиц и около 2000 тяжелых [174]. Из изложенного следует, что число ФС / и ФС II должно быть примерно одинаково. Отсюда можно заключить, что в каждой тяжелой частице содержится две

ФС//.

В работающих хлоропластах наблюдаются медленные изме­нения поглощения при 4750 и 5150 А, происходящие за секун­ды [70]. В этих же спектральных областях наблюдаются быст­рые изменения поглощения со временем появления полос, мень­шим Ю-5 с, и временем исчезновения 20 мс [71]. Быстрые изме­нения являются индикаторами окислительно-восстановитель­ных реакций. Установлено, что они происходят параллельно с фосфорилированием. Они отражают изменения электрического поля поперек мембраны, их исчезновение связано с транспор­том протонов и других ионов. Действительно, при увеличении проницаемости мембраны для ионов в результате осмотического шока изменения исчезают быстрее. Это происходит и при дей­ствии разобщителей фосфорилирования, увеличивающих про­ницаемость для протонов. Наконец, ионофоры, такие как гра­мицидин D, увеличивающие проницаемость к щелочным ионам, также ускоряют исчезновение спектральных изменений [44], причем имеется четкая зависимость от концентрации грамици­дина. Были проведены опыты со слоями Chi a, Chi Ь и каро - тиноидов на стеклянных пластинках. Слои подвергались дей­ствию электрических полей с напряженностью до 106В/см и измерялись изменения поглощения. Они оказались совпадаю­щими с изменениями в хлоропластах, индуцированными све­том [44]. Изменение поглощения А ЦІ = АЛ линейно зависит от изменения потенциала Atf

Z=q/C = a АЛ.

Здесь q — заряд, перенесенный через мембрану, С — емкость мембраны, примерно равная 1 мкФ, а ж 50 мВ/ДЛ. Кроме того, работает «молекулярный амперметр», и ток через него равен

(7.9)

При вспышке, вызывающей один оборот, через мембрану пере­носится два элементарных заряда е на одну электронную цепь. Из экспериментальных данных следует, что при этом Д-ф да да 50 мВ, при длительных вспышках Афтах ~ 200 мВ, а при стационарном освещении Аф да 100 мВ. Исследование световых реакций показывает, что поле создается наполовину реакцией в ФС / и наполовину — реакцией в ФСП [44].

С помощью стеклянного электрода и индикаторов обнару­жены и изменения рН, сопровождающие фотосинтез. При убы­вании электрического поля одновременно нарастает рН [72]. Согласно оценке отношение числа поглощенных протонов к числу перенесенных электронов равно 2 (дальнейшие подроб­ности см. в [44]).

Эти результаты качественно согласуются с хемиосмотиче - ской теорией Митчелла (см. § 6.4), согласно которой перенос электронов дает свободную энергию для фосфорилирования в форме градиентов ф и рН (см. также [73]).

При вспышке, вызывающей один оборот, Аф 50 мВ, но АрН очень мало, значительно меньше единицы. Значит, в этих условиях фотосинтез протекает независимо от АрН. Показано, что при единичной вспышке фосфорилирование действительно происходит за счет Аф с выходом АТФ 0,30 на вспышку и не­зависимо от интервала между вспышками. Фосфорилирование блокируется грамицидином D. При значениях Аф, больших 50 мВ, количество возникающего АТФ пропорционально Аф. Отсюда следует, что электрическая энергия используется для продукции АТФ [74].

На рис. 7.22 показана общая схема сопряжения различных процессов в фотосинтезе, предложенная Виттом [44]. На ри­сунке показан участок тилакоидной мембраны. При фотосин­тезе происходят следующие события, перенумерованные на ри­сунке:

Миграция и диссипация энергии. Энергия запасается и затем диссипирует в Саг*, а также в результате флуорес­ценции.

Световые реакции, описанные выше (см. стр. 366).

Образование электрического поля вследствие направлен­ного переноса электронов перпендикулярно к мембране, опре­деляемого анизотропной ориентацией молекул.

Перенос электрона и втекание в мембрану протонов в соответствии с теорией Митчелла (см. §§ 6.4, 6.5): два электро­на на внешней стороне мембраны замещаются двумя ионами ОН, а две дырки (+) на внутренней стороне мембраны — дву­мя протонами. Возможный механизм протеолитические реак­ции, сопряженные с переносом электрона от Н20 к НАДФ+.

5. Образование АрН. Связанные ОН - и Н+ могут замещать­ся Ch и К+. ОН~ и Н+ диффундируют соответственно во внеш­нюю и внутреннюю фазы, что создает разность АрН.

У/\ - іу/у/^Я - уу/ум СЩ 50~г00мВ

По)

(1) ЇЩ ІЩ, (Z)\ CM а; ШдП

Миграция энергии

Световые реакции

Отражение паля

V (7)

(4) I Перенес шетрона I — —

Химжееки управляемый

при/пен

К+0Н~ 1 К+0Н"

H+DH~ Н+0Н"

І і,

■с» АТФ

Метек iF - тЗ действием поля

//сток К+ лед действием поля

♦ I ц „

Л у уГ

ШнАш

Н Д Л ltl-Н+Н +W/M(ry/,

(В)

Исчезновение поля

АДФ •

Ос/ин aiopom (8)

Н+ І Н+

Убыль V йрН

Образование АТФ

(3)

Диірірузиошв/й. притек К++ Н*

У/////,Г\у, у//. УУГЛ-Л

Рис. 7.22. Схема сопряжения молекулярных процессов в фотосинтезе по

Витту.

Управляемое полем истечение протонов и убывание АрН.

Управляемое полем истечение К*.

Диффузионная убыль АрН.

Фосфорилирование, сопряженное с разрядкой электриче­ски энергизованной мембраны в соответствии с теорией Мит­челла.

10. Регуляция внутреннего значения рН\ При рН1' да 8 Не­проводимость мембраны больше, чем Непроводимость. При генерации Н+ (п. 4) возрастание [Н+]» замедляет поток элек­тронов, что, в свою очередь, замедляет генерацию Н+. Возра­стание [Н+]' увеличивает вытекание Н+, что происходит за счет вытекания К+. [Н+]* поддерживается на определенном уровне. Она возрастает с увеличением частоты вспышек или интенсив­ности света. В свою очередь, ускоряется процесс 6 и фосфори­лирование (процесс 9).

Таким образом, энергия световых квантов заряжает мембра­ну. В правой части рис. 7.22 показано, как используется эта энергия.

Положения, суммированные в приведенной схеме, подтверж­даются многочисленными и разнообразными опытными фак­тами. Однако механизмы соответствующих процессов еще не установлены, и эту схему следует пока считать гипотетической.

(7.10)

(7.П)

Вместе с тем, как подчеркивается в монографии [170], при­менение теории Митчелла к фотосинтезу встречается с трудно­стями при количественных оценках. В этой теории свободная энергия протонов должна превышать энергию фосфорилиро­вания

ПцОн ^ Оф.

Здесь Оф да 0,5 эВ да 11,5 ккал/моль, пц — число протонов, пе­ремещение которых приводит к фосфорилированию. В естест­венных условиях при Аф = 50 мВ и АрН « 2—2,5 имеем

Он = е Аф + /гбТ • 2,3 АрН да 0,18 эВ.

Следовательно, «н должно быть не менее трех [175, 176]. В ра­боте [177] дается близкая оценка — утверждается, что для син­теза 1 моля АТФ нужны 4 протона. С другой стороны, из соот­ношения АТФ/е - = 2 и Н+/е~ = 2 следует, что на 1 моль АТФ расходуются 2 протона. В условиях импульсного освещения по-прежнему Аф = 50 мВ, а АрН = 0. Число протонов состав­ляет 0,5/0,005= 10. Но отношения АТФ/е~ и Н+/е~ те же и, значит, не хватает энергии восьми протонов.

Таким образом, для применения теории Митчелла к фосфо­рилированию при фотосинтезе необходим дальнейший анализ, прежде всего уточнение количественных характеристик про­цесса.

Вместе с тем феноменологическая картина, следующая из всех имеющихся данных, хорошо согласуется с теорией Мит­челла.