ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ЭЛЕКТРОННО-КОНФОРМАЦИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Самые общие соображения показывают, что перенос элек­трона, сдвиг электронной плотности в конденсированной ср. еде должны сопровождаться изменениями положений атомов, атом­ных ядер среды. Все степени свободы молекулярной системы, т. е. системы, состоящей из ядер и электронов, взаимосвязаны. В биополимерной системе наименьших затрат энергии требуют повороты атомных групп, т. е. конформационные движения. Сле­довательно, в такой системе электронный транспорт сопряжен с конформационными движениями, и должны реализоваться электронно-конформационные взаимодействия (ЭКВ) (см. [3], § 6.7, [72'). Конформационные перестройки должны сопрово­ждать и перемещение ионов. Движение электрона (и зарядовой плотности) в биополимерной системе, в частности, в мембране, сопряженное с конформационными движениями, может трак­товаться как перемещение квазичастицы — конформона [73]. В надмолекулярной системе конформационные перестройки могут приводить к механическому движению на макроскопическом уровне.

Эти общие представления, в той или иной форме фигуриру­ющие в научной литературе, применяются рядом авторов к рас­смотрению процессов, протекающих в митохондриальных мем­бранах. В работах Грина и Джи [26, 27] предложена так назы­ваемая электромеханохимическая модель структуры и функции митохондрий, исходящая из рассмотрения конформационных свойств элементарных частиц митохондрий (ЭЧМ, см. стр. 308). Предполагается, что ЭЧМ может существовать в различных конформационных состояниях — в основном неэнергизованном состоянии и в возбужденном, метастабильном энергизованном состоянии. Свободную энергию данного состояния можно пред­ставить в виде суммы химической, электрической и механиче­ской энергий

G = °хим + °эл + Омех. (6.67)

При переходе из основного состояния в энергизованное, не со­провождаемом суммарным изменением свободной энергии, AG = 0 и, следовательно,

Д0х11и + Д0,л + Д0иех = 0. (6.68)

Отдельные вклады в этой сумме могут изменяться, т. е. имеется электромеханохимическое сопряжение — один вид энергии пре­вращается в другой. Элементарную модель системы с взаимо­превращением трех видов энергии можно представить двумя противоположно заряженными телами, соединенными пружи­ной. При колебаниях такой системы происходят взаимные пре­вращения электростатической, потенциальной и кинетической энергий.

Грин и Джи считают, что ЭЧМ характеризуется направлен­ным разделением зарядов при энергизации. Энергизапия явля­ется результатом каталитической конверсии химической энергии субстрата в энергию супермолекулы, т. е. ЭЧМ. Возникающее вследствие энергизации электрическое поле индуцирует допол­нительное поле в других структурных компонентах ЭЧМ. Энер­гизованное состояние стабилизуется электростатическими взаи­модействиями. В этом метастабильном состоянии оказывается возможной эндергоническая химическая реакция (фосфорили­рование), происходит дезэнергизация, и система релаксирует в конечное состояние, конформационно сходное с начальным. Триггером деполяризации системы являются локальные конфор - мационные перестройки в активных центрах. Окисление проис­ходит в нижней части супермолекулы (в подставке ЭЧМ), фос­форилирование — в ее верхней части (в головке ЭЧМ).

Имеются поучительные черты сходства и различия этой мо­дели и топливного элемента. В топливном элементе химические реакции, протекающие как при поляризации, так и при деполя­ризации, имеют характер окисления и восстановления, в моде­ли ЭЧМ такова лишь реакция в нижней, но не в верхней части. В топливном элементе обе реакции относятся к экзергониче - ским, в модели ЭЧМ поляризация является экзергонической, а деполяризация — эндергонической реакцией. В топливном эле­менте происходит реальный перенос электронов, в модели ЭЧМ нет переноса электронов между участком окисления и участком фосфорилирования, и дело сводится к возникновению и дей­ствию электрического поля.

В процессе энергизации при гидролизе АТФ происходит кон­формационная поляризация головки ЭЧМ, что индуцирует по­ляризацию основания.

Согласно изложенным выше идеям, изменение свободной энергии в ходе фосфорилирования слагается из изменений хи­мической и электромеханической энергий, причем два таких вклада дополнительны друг к другу.

В работе [26] предлагается далеко идущая детализация структуры ЭЧМ и локализация в них различных стадий окис­лительного фосфорилирования. Такая детализация (октетная структура головки и т. д.) реальных оснований не имеет. Рав­ным образом нельзя считать аргументированными конкретные представления о конформационных состояниях ЭЧМ, различаю­щихся выдвижением головки на 50 А. Укажем в связи с этим на еще не вполне опровергнутые сомнения в самом существова­нии таких структур (см. стр. 290).

Грин и Джи считают электромеханохимическую модель аль­тернативной хемиосмотической модели Митчелла. В последней модели мембранный потенциал генерируется вследствие пере­мещения протонов в пространстве между кристами и ионов ОН~ в матриксе, вызванного перемещением электронов и пере­носчиков водорода во внутренней мембране. В электромехано - химической модели мембранный потенциал возникает непо­средственно в результате окислительно-восстановительного процесса в ЦПЭ. Разделение зарядов в электронно-транспорт­ной системе объясняется локализацией переносчиков электро­нов в одной части внутренней мембраны и переносчиков прото­нов—в другой ее части. Другое различие состоит в том, что в модели Грина и Джи протоны, отделенные от окисляемого суб­страта, не покидают мембранную фазу. Изменение рН во внеш­ней среде считается результатом конформационных перестроек белков вблизи разделенных зарядов и воздействия этих пере­строек на состояние внешней среды и матрикса.

В действительности между двумя моделями нет принципи­альных противоречий. В сущности, их трудно сравнивать. Хе - миосмотическая теория является феноменологической, ее основ­ные постулаты и выводы не зависят от локализации стадий окислительного фосфорилирования. Модель Грина и Джи су­щественна в том отношении, что в ней в явной форме фигури­руют конформационные перестройки мембранной структуры, несомненно происходящие в действительности. Недостаток мо­дели— чрезмерная ее детализация, лишенная достаточно стро­гих оснований. Поэтому конкретный механизм электромехано - химического сопряжения, предлагаемый Грином и Джи, имеет умозрительный характер. Согласие модели с рядом опытных фактов (см. [26, 27]) нельзя считать ее доказательством.

Конформационная концепция Грина, из которой исходит электромеханохимическая модель, формулируется им как уни­версальная [74]. Грин подчеркивает четыре основных принципа биоэнергетики: 1) конверсия тепловой энергии в электромеха - нохимическую, осуществляемая белком, 2) способность энерги - зованного фермента поляризовать чувствительные связи в мо­лекуле субстрата, выполняющей цикл поляризации и деполя­ризации, 3) сопряжение переноса групп, 4) энергетическое со­пряжение посредством комплементарных, векторных потоков зарядов в центрах экзергонических и эндергонических реакций. Фермент считается упругой трехмерной средой, совершающей колебания как целостная система. Молекулы белка периоди­чески переходят из растянутого состояния в сжатое и обратно с частотами порядка 103—106 с-1, отвечающими частотам фер­ментативных реакций. В ходе этих колебаний происходит пере­ход одной формы энергии в другую, возникает конформация, соответствующая выполнению специфической работы, и пони­жается активационный барьер реакции превращения субстрата в продукт. Фермент есть машина, превращающая тепловую энергию в электромеханохимическую в фазе энергизации и вы­полняющая обратное превращение в фазе дезэнергизации. Грин возлагает надежды на исследования медленных колебаний фер­ментов методом комбинационного рассеяния с использованием лазерной техники.

Каталитическое действие фермента определяется поляриза­цией субстрата: фермент служит поляризующим агентом, а субстрат — поляризуемым веществом. В окислительных реак­циях взаимодействие фермент — субстрат включает перенос эле­ктронов.

Эти качественные представления согласуются с неоднократ­но высказывавшимися идеями (см. [3], § 6.7, а также [75—77]). В общем виде они не могут вызвать возражений, однако истинная физика электронно-конформационных взаимодействий требует количественных теоретических и экспериментальных ис­следований. При этом вряд ли можно рассчитывать на прямое изучение медленных колебаний ферментов методом комбина­ционного рассеяния, так как медленные колебания несомненно существуют и в окружающей среде и их наблюдение весьма затруднительно.

Говоря о митохондриальных мембранах, необходимо прежде всего экспериментально установить наличие в них конформа­ционных превращений. В § 3.8 уже были приведены некоторые данные такого характера, относящиеся к возбудимым мембра­нам. Здесь мы остановимся на результатах, полученных с по­мощью молекулярных меток, или зондов, — люминесцентных [78] и главным образом спиновых. Исследования биомембран митохондрий, меченных иминоксильными радикалами, методом электронного парамагнитного резонанса были проведены в ра­ботах Блюменфельда, Кольтовера и др. [79—84'. С помощью спиновых меток была изучена сорбция воды мембранами лио - филизованных СМЧ (а также хлоропластов, см. гл. 7). Время корреляции т, определенное из спектра ЭПР и характезирую - щее подвижность метки, оказалось немонотонно зависящим от содержания сорбированной воды — с его увеличением т прохо­дит вначале через минимум, затем достигает максимума, после чего монотонно убывает. Эти результаты можно считать указа­нием на структурные переходы у молекул в мембране, имею­щие кооперативный характер. При переходе увеличивается чис­ло гидрофильных групп, контактирующих с водой и, следова­тельно, сорбирующая поверхность мембраны. Переходы про­исходят при концентрациях воды в препарате, равных 8—12 и 18—23%- Авторы связывают первый переход с гидратацией, второй — с изменением фазового состояния липидов в мембране. Такое толкование нельзя считать однозначным, но наличие пе­реходов установлено.

Установлено также, что восстановление дыхательной цепи СМЧ сукцинатом или НАД-Н изменяет анизотропию спектра ЭПР спиновой метки. Более четкие результаты дали работы с гидрофобными метками. Оказалось, что добавление АТФ к сус­пензии неэнергизованных СМЧ вызывает значительные измене­ния спектра ЭПР — АТФ улучшает растворимость гидрофобной метки в мембранах СМЧ. По-видимому, такое изменение опре­деляется конформационными изменениями структуры мембра­ны. Сходное влияние АТФ наблюдается и в интактных мито­хондриях. ДНФ и олигомицин в концентрациях более 1 мкг на 1 мг белка ингибируют этот процесс. При малых концентрациях (0,1—0,2 мкг на 1 мг белка) олигомицин подобно аллостериче - ским активаторам усиливает индуцированные АТФ конформа­ционные переходы в СМЧ. Изучение мицелл фосфолипидов, по­лученных из митохондриальных мембран, показало, что разоб­щители вызывают конформационные изменения липидов.

Зависимость параметра солюбилизации гидрофобной метки в мембране от концентрации АТФ имеет S-образную форму. Это свидетельствует о кооперативности перехода (см. [3], §7.5).

Параметр Хилла для такой кривой равен 6, в присутствии олигомицина он убывает до 5 и даже до 4. Разность свободных энергий оценена в 1,8 ккал/моль. Примерно такие же величины получаются при обработке Данных по действию ингибитора ан - тимицина на скорость дыхания [85]. Кривая зависимости инги - бирования восстановления цитохрома b в СМЧ [86] характери­зуется параметром Хилла, равным 4,5, и AG = 2,3 ккал/моль независимо от природы донора электронов. Высокая коопера - тивность этих процессов указывает на олигомерное строение мембран.

Анализ температурной зависимости параметров спектров ЭПР спиновых и флуоресцентных меток в СМЧ (а также в хлоропластах и в микросомах) показал существование терми­ческих структурных переходов в мембранах вблизи 20 и 40 °С. При таких температурах происходят скачкообразные изменения энергии и энтропии активации ферментативных процессов.

Ограничимся этими немногими фактам. Все они (а также ряд других результатов) указывают на наличие конформацион­ных превращений в митохондриальных мембранах, в частности, возникающих при их энергизации. Таким образом, исходное по­ложение электромеханохимической гипотезы можно считать вполне приемлемым. Однако физика соответствующей модели действия сопрягающих мембран не может еще считаться разра­ботанной.

Блюменфельд [79, 83] выдвинул гипотезу релаксационных конформационных переходов в митохондриальных мембранах. Допустим, что элементарный акт состоит в присоединении элек­трона к активному центру макромолекулы (скажем, к группе гема цитохрома при его восстановлении). Нейтральной форме макромолекулы соответствует определенная равновесная кон- формация I, заряженной (восстановленной)—другая равновес­ная конформация II, заметно отличающаяся от исходной. Элек­тронный перенос, т. е. восстановление, происходит значительно быстрее конформационного изменения. Следовательно, при про­текании элементарного химического акта образуется неравно­весное конформационное состояние — электрон перешел, но конформация не успела подстроиться к новой ситуации. В этом состоянии структура макромолекулы напряжена, она обладает повышенной конформационной энергией.. Затем происходит медленная релаксация конформация макромолекулы к равно­весному состоянию II. Переход можно представить схемой (минус обозначает электрон)

1 быстро^ 1 медленно"*" И быстро"*" И медленно"*"

Энергия, выделяемая в элементарном акте, запасается в форме конформационной энергии в течение времени релаксации. Со­гласно [79, 83] в этом и состоит сущность первичного макроэрга. За время релаксации конформационная энергия трансформи­руется в химическую. Можно думать, что в пункте сопряжения существует лабильный комплекс между переносчиком и какой - либо группой в активном центре фермента сопряжения, роль которой скорее всего играет аденин связанного АДФ [87]. При релаксации 1~ —>• II - в какой-то момент энергетический уровень, на котором находится электрон, понижается до акцепторного уровня аденина. Уровни переносчика и аденина оказываются разделенными барьером, но в такой системе возможен туннель­ный переход электрона на аденин [88]. В работе [89] (см. также [79]) показано, что увеличение электронной плотности на аде - нине сопровождается резким повышением основности амино­группы. Если в состав активного центра фермента сопряжения АТФ-синтетазы входит электрофильная группа, например, кар­боксил, то аденин реагирует с нею, образуя амидную связь. В следующий момент релаксации уровень переносчика оказы­вается ниже уровня аденина. Электронная плотность переходит с аденина обратно на редокс-группу того же или следующего переносчика электрона ЦПЭ, и связь аденина с карбоксилом лабилизуется. На основе той же модели рассмотрено действие разобщителей.

В работах Блюменфельда и Чернавского [90—92] (см. также [79, 111]) дано обобщение этой концепции применительно к трактовке элементарного акта любой ферментативной реакции. Формулируется «постулат, согласно которому конформационное изменение субстрат-ферментного комплекса, следующее за при­соединением субстрата к активному центру фермента, вклю­чает в себя кроме разрыва старых и образования новых вто­ричных связей в макромолекуле белка также химические изме­нения субстрата, превращающие молекулу субстрата в моле­кулу или молекулы продукта. Таким образом, элементарный акт ферментативной реакции заключается в конформационном из­менении макромолекулы (фермент-субстратного комплекса), и скорость превращения субстрат — продукт определяется ско­ростью этого конформационного изменения». На рис. 6.19 при­ведена схема энергетических изменений на разных стадиях ка­талитического разрыва некоторой связи А—В субстрата. В бы­строй стадии 1 присоединения субстрата к ферменту происхо­дит выделение свободной энергии ДG\. Конформация белка не успевает перестроиться и остается напряженной. На стадии 2 происходит медленная релаксация комплекса к новому равно­весию и превращение субстрата в продукт (Е— новая конфор­мация фермента). Свободная энергия понижается на величину AG2. Далее, в стадии <9 комплекс распадается на фермент и продукт, но фермент остается в напряженной конформации Е,

А—8 + Е (А—6)Е АЕВ Е + А+В-^Е + А+В

Рис. 6.19. Энергетические изменения в последовательных стадиях каталити­ческого процесса.

Медленно релаксирующей к равновесию в стадии 4. Общее по­нижение свободной энергии равно

AG = А С?! Н - AG2 + AG3 + AG4. (6.68а)

Это — термодинамическая модель. Кинетика процесса в цити­рованных выше работах фактически не рассматривается. Блю - менфельд считает уравнение Аррениуса или Эйринга неприме­нимым к ферментативным реакциям [79, 91]. Утверждается, что система не характеризуется свободной энергией активации в обычном смысле слова — все молекулы субстрата, образовав­шие надлежащий комплекс с ферментом, релаксирующим к но­вому конформационному состоянию, претерпевают химическое превращение. Влияние температуры на скорость реакции опре­деляется не изменением числа молекул, способных преодолеть некоторый активационный барьер, но изменением исходной конформации и, следовательно, пути и скорости последующей релаксации [92] (см. также [79, 111]).

Для построения кинетической теории необходимо исследо­вать относительную роль двух механизмов переноса электро­на — надбарьерный переход по Эйрингу (см. [3], § 6.1) и тун­нельный эффект (см. [79, 92, 111]). Туннельный эффект при переносе электрона в биологической системе был впервые рас­смотрен Чансом применительно к бактериальному хлоро­филлу [114—116].

І I М. В. Волькенштейн

Константа скорости активационного перехода равна

= ехр (_£), (6.69)

+

Где F+ — свободная энергия активации. Число актов туннель­ного перехода в единицу времени равно

K2 = Vq ехр [- V2т {U - Е) ], (6.70)

Где vo — частота «колебаний электрона» в молекуле, участвую­щей в цепи переноса, скажем, в цитохроме с — величина порядка

Белков и липидов; соответственно, ширины барьеров L порядка размеров этих молекул, т. е. 10—20 А.

Поведение электрона при его туннелировании зависит от со­отношения между разностью электронных уровней ДЕ (см. рис. 6.20) и величиной резонансного расщепления

AEr = Eexp[-j л/2т(£/-£)]. (6.71)

Если ДЕ ДЕг, то туннельного перехода не будет. При АЕ^.АЕГ переход произойдет за время тг = h/AEr. При L«20A, U — Е ж 2 эВ, АЕГ ~ 10~6 эВ. Реальные значения ДЕ в ЦПЭ должны быть много больше, и такой идеальный переход невоз­можен. Туннелирование становится, однако, возможным вслед­ствие диссипации энергии, обеспечивающей сближение электрон­ных уровней. Именно ЭКВ создают возможность такой дисси­пации. Чернавская и Чернавский [111] рассматривают случай потенциальных ям, защищенных от ионной среды неполярной оболочкой. Вблизи места локализации электрона можно выде­лить лишь несколько заряженных групп, сильно связанных с электроном. Рассматривается в качестве предельного случая лишь одна колебательная степень свободы. В этой ситуации возможно возбуждение колебательного кванта hк, причем

Д£ = ficoK = £К; (6.72)

Или увеличении энергии уже присутствующего кванта

АЕ = АЕК = Н Д®к. (6.73)

Значения Ек и Д£к порядка 0,1 эВ. Вероятность туннельного пе­рехода при условии (6.72) выражается формулой

А; = р (ДЕ) g2 ехр[- Ц - <s/2m{U - Е) ]. (6.74)

Здесь р(Д£)—плотность уровней конечного состояния, g2 = = Ю-2—10~4—константа, характеризующая «силу связи». Если имеет место случай (6.73), то

®=^р(Д£-Д£к)ехр(-|^-)ехр[--^ л/2m(U - Е)\ (6.75)

Функцию р можно представить либо в лорентцовой, либо в гаус­совой форме. Последняя имеет вид

Она имеет резкий максимум при АЕ = АЕК и быстро убывает при АЕ~ Д£К>ГК. Ширина резонансной области Гк порядка Ю-2 эВ.

Электронно-конформационные взаимодействия (по термино­логии Чернавского электронно-конформационные переходы, ЭКП) могут трактоваться именно таким способом. Как указано в цитированных выше работах (см. [3], § 6.5, а также [72, 73, 111]), ЭКВ происходят при попадании электрона в поляризуе­мую среду, образованную группами макромолекулы. Среда по­ляризуется, и образуется самосогласованное поле, эквивалент­ное потенциальной яме для электрона. Такое образование в физике твердого тела называется поляроном. Если поляриза­ционная деформация приводит к состоянию, отделенному от исходного энергетическим барьером, то мы имеем дело с нели­нейным поляроном. В биополимерах поляризация приводит к движению по конформацнонный степеням свободы — нелиней­ный полярон является конформоном.

Чернявская и Чернавский дают грубую оценку энергии и размеров конформона [111]. В среде, содержащей равномерно распределенные ионы массы М, взаимодействующие по закону Кулона, имеем согласно теореме вириала

'/2 Mv2 « е2/г. (6.77)

Скорости v и расстоянию г соответствует частота колебаний

V / 8я е2 _оч

®к = т = д/— ЖП, (6.78)

Где п = (4/ззхг3)-1 — число ионов в единице объема. Взаимодей­ствуя с колебаниями ионов, электрон приобретает энергию ficoK и

4

Импульс <7 = д/2шЙсок = д/Am2h2a>\, где т — масса электрона. Согласно соотношению неопределенностей соответствующий раз­мер электронного облака равен

4 4

» =А — ^ /-Л * /JL ^ Г h2M

Q 2отсйк — Л/ 32я Л/ т2е2п '

Вводя боровский радиус ао = Ь2/те2 « 0,5 А, получаем

Х - IfJI л/Ж = "о л/IF л/^ ■ (6-79)

V 32п \ тп V 32я \J т па\ v '

Размеры полярона (конформона) должны быть того же порядка. Энергия поляризации по порядку величины равна

Ер^е'/еК, (6.80)

Где є— микроскопическая диэлектрическая проницаемость. На­конец, отношение Ер к энергии колебаний дает число квантов, участвующих в образовании полярона,

JV = Ј;//jo)k. (6.81)

Для белков среднее значение плотности зарядов я ~ 1021 см-3, т. е. расстояние между зарядами порядка 10 А. Если заряды расположены на протонах, то М = (6,2-1023)~' г. Величину є можно считать равной 3. Получаем сок я* 3,5-1013 с-1, размеры полярона Я « 15 А, т. е. поляризацией охвачена практически вся макромолекула. Энергия поляризации Ер « 0,35 эВ, сдвиг уров­ней электрона того же порядка. Наконец, N примерно равно 15.

В кинетике электронно-конформационных переходов можно выделить четыре процесса [111].

Колебания электрона внутри одной ямы, размером в не­сколько ангстрем, с частотами порядка 1017 с-1.

Колебания атомов с частотами порядка k^T/h ~ 1013 с-1 и с амплитудами порядка Ю-1—Ю-2 А; частоты упругих колеба­ний белковой глобулы как целого порядка I0-i2—10~" с-'.

Туннелирование электрона; как уже сказано, ему отве­чают времена порядка Ю-7—Ю-6 с и расстояния порядка 10—20 А.

Конформационные переходы в макромолекуле с време­нами 10_3—Ю-1 с; возможны и значительно более медленные переходы (см. § 8.6).

Соответственно можно не рассматривать быстрые процессы 1), 2), 3) и пользоваться усредненными по времени значениями электронной плотности в ямах и усредненными положениями колеблющихся атомов. Именно такая процедура применена в описанной выше модели релаксационных ЭКП. Молекула — акцептор электрона, получив электрон, оказывается в неравно­весной конформации, медленно превращающейся в равновесную. Поэтому для туннельного эффекта требуется не совпадение электронных уровней восстановленных донора и акцептора в их равновесных конформациях, но наличие надлежащим образом расположенного виртуального электронного уровня акцептора в окисленной конформации. Энергия, выделившаяся при тунне - лировании, диссипирует, но энергия, медленно выделяемая при конформационной релаксации к новому равновесному состоя­нию, может быть конвертирована в энергию макроэрга (ср. так­же [93]). Так как туннельный эффект связан с условиями резо­нанса электронных уровней энергии, он подвержен влиянию мембранного потенциала. Следовательно, возможен регулятор - ный процесс, состоящий в том, что мембранный потенциал, создаваемый активным транспортом ионов, зависит от скорости переноса электронов, которая, в свою очередь, регулируется мембранным потенциалом. Реализуется обратная связь, обеспе­чивающая автоматическое поддержание системы в условиях, близких к резонансным [79].

Изложенная концепция дает гипотетическое качественное описание электронно-конформационных взаимодействий в фер­мент-субстратном комплексе. Однако мы не располагаем пока теорией, количественно объясняющей скорость ферментативной реакции, в частности, кинетику переноса электронов в мито - хондриальной системе. Задача такой теории состоит в нахожде­нии поверхности свободной энергии фермент-субстратного комп­лекса как целостной системы, обладающей электронными и кон - формационными. степенями свободы, и в нахождении пути процесса. Сама эта поверхность действительно должна меняться с температурой.

При рассмотрении пути процесса следует учитывать «кон- формационную» природу явления. Иными словами, положения электронных уровней энергии зависят от динамического состоя­ния среды — белка, обладающего конформационными степенями свободы. Вследствие медленности конформационных движений система является адиабатической. Основные положения упро­щенной модельной теории, развитой в работах [94—96], изло­жены в § 6.7 книги [3]. В последующих работах Кришталика [97] проведено более детальное рассмотрение фермента, учи­тывающее наличие в его молекуле большого числа поляр­ных групп, обладающих ограниченной подвижностью. В этих условиях в ходе процесса должен осуществляться перенос за­ряда в положения, оптимальные для заданной конфигурации Диполей. Тем самым реализуется определенная предоргани - зация среды, способствующая повышению скорости фермента­тивных реакций и благоприятствующая эстафетному переносу зарядов на дальние расстояния. Рассмотрено также одновремен­ное прохождение двух реакций переноса заряда. При благо­приятных геометрических условиях возможно сильное сопряже­ние двух процессов, в частности, протекание эндергонической реакции за счет экзергонической.

Теория Блюменфельда и Чернявского, основанная на рас­смотрении ЭКВ, существенно отлична от модельных представ­лений, используемых в феноменологической теории Митчелла. Представления об ЭКВ (или ЭКП) имеют более реальные и глубокие физические основания. Переход от этих представлений к феноменологическому, общему описанию и его согласование с положениями теории Митчелла, подтвержденными опытом, по - видимому, окажутся возможными в дальнейшем. Для этого не­обходимы не грубые оценки и качественные гипотезы типа пред­ложенных в работах [26, 73, 74, 90], но подлинная количествен­ная теория конформона (или нелинейного полярона). Такая тео­рия пока не создана. Ее построение связано с исследованиями конкретных процессов, учитывающими детали поведения элек - тронно-конформационной системы. Эти детали не могут быть получены из умозрительной картины (см. [26]), но лишь из экс­периментальных данных, которых дока недостаточно. Тем самым сейчас нет еще возможности строить атомно-молекулярную тео­рию ЦПЭ в целом. Следует начать с рассмотрения отдельных звеньев процесса, с изучения поведения отдельных ферментов — переносчиков электронов.

§ 6.7. ЦИТОХРОМ о

Были проведены рентгеноструктурные исследования окислен­ной и восстановленной формы цитохрома с [98—100].

Среди участников ЦПЭ в митохондриях именно цит с наибо­лее доступен для изучения переносчиков электронов. Этот белок можно выделить в чистой форме и закристаллизовать. Осталь­ные компоненты удается пока выделить лишь в виде мульти - ферментных комплексов: цитохромы 6 и Сі как комплекс цито - хромредуктазы и цитохромы а и а% как цитохромоксидазу. Ре - дуктаза снабжает цит с электронами, оксидаза отбирает их у цит с.

Задолго до рентгенографических исследований было прове­дено изучение первичной структуры цит с из более чем 40 раз­личных организмов, начиная с низших растений и кончая обезьянами и человеком (см. [3], § 2.5, [10]). Результаты этих работ очень существенны и в биологическом, и в биофизическом аспектах.

Молекулы цит с позвоночных содержат 104 аминокислотных остатка, насекомых—107, низших растений—107—109, высших растений— 111 (в одном случае 110). Последовательности остат­ков хорошо отражают биологическую эволюцию. Так, первичные структуры цит с человека и шимпанзе тождественны, отличаясь от структуры цит с обезьяны резуса только одной заменой из 104 остатков — у резуса на 102-м месте фигурирует Ала, вместо Тре. Цит с гремучей змеи отличается от цит с пекарских дрож­жей добавлением 5 остатков с N-конца, удалением последнего остатка с С-конца и 40 заменами, а от цит с человека—12 ос­татками. Примечательно, что большинство замещений во всех исследованных цит с консервативно в том смысле, что мутацион­ная замена сохраняет характер остатка. Можно разбить амино­кислотные остатки на 6 классов: гидрофобные ароматические (Фен, Трп, Тир), гидрофобные алифатические (Иле, Лей, Мет, Вал), гидрофильные основные (Гис, Лиз, Apr, Лиз — СН3), гид­рофильные кислотные (Асп, Глу), амбивалентные, т. е. малые гидрофобные или незаряженные полярные (Ала, Асн, Цис, Про, Глн, Сер, Тре) и, наконец, остаток глицина Гли, не имеющий боковой цепи. Оказывается, что эволюционные изменения цит с во всей живой природе от низших растений до человека сводят­ся, как правило, к замещениям внутри одного класса, и лишь в малом числе случаев к изменению класса остатка. Это указы­вает на далеко идущее сходство пространственной структуры всех цит с.

В ходе эволюции клетки перешли от анаэробных процессов к дыханию как источнику энергии. Именно на этой стадии, реа­лизовавшейся примерно 1,2 миллиарда лет назад, возникли ци - тохромы. Это весьма древние белки, функциональная структура которых очень точно стабилизована естественным отбором, о чем свидетельствует то обстоятельство, что цитохромы с, выде­ленные из любого эукариота — растения, животного или микро­организма, реагируют in vitro с цитохромоксидазой любого дру­гого вида [101].

Сходство структуры всех цитохромов с выражается не только в постоянстве расположения 6 классов остатков. Некоторые уча­стки цепи вообще не варьируют. 35 из 104 положений заняты одними и теми же остатками в цит с всех изученных видов, включая длинную последовательность от 70-го до 80-го остатка:

Асн — Про — Лиз — Лиз — Тир — Иле — Про — Гли —

Тре — Лиз — Мет —

35 инвариантных мест заняты 15 различными остатками. Дру­гие 23 места заняты только одним или двумя различными, но весьма сходными остатками. В 17 местах возможны лишь за­мены в пределах трех остатков на каждом месте. С другой сто­роны, имеются немногие места, для которых оказываются допу­стимыми самые различные замены; сюда относится, например, остаток № 89 [101].

Эти свойства первичной структуры всех цитохромов с пока­зывают, что пространственное строение фермента, ответственное в конечном счете за его биологическую функциональность, фик­сировано достаточно строго. Мутационные нарушения первичной структуры, приводящие к сколько-нибудь существенным измене­ниям строения глобулы, элиминируются естественным отбором, будучи летальными. В этом смысле цит с фиксирован точнее, чем гемоглобин, не говоря уже о фибриллярных белках, но менее строго, чем гистоны (см. стр. 46).

Таковы важные выводы, которые следуют из изучения пер­вичных структур 40 различных цитохромов с. Ответ на вопрос о смысле наблюдаемого консерватизма последовательности остатков дает рентгеноструктурный анализ.

На рис. 6.21 изображена структура окисленного цитохрома с лошади, установленная Дикерсоном и его сотрудниками [101]. Ее рассмотрение показывает, что группа гема соединена пятой и шестой валентностями атома железа с имидазольным кольцом Гис 18 и атомом серы Мет 80. Гем связан ковалентно также с Цис 14 и Цис 17. Гем расположен в глубокой выемке, причем его окружение весьма консервативно в эволюции. Инвариантная последовательность 70—80 также является частью ближайшего окружения гема.

Структура цит с характеризуется, как обычно, расположе­нием гидрофобных остатков внутри молекулы (см. [3], § 4.6, 4.7),

Рис. 6.21. Структура окисленного цитохрома с лошади.

Тогда как заряженные группы, кислотные или оснбвные, нахо­дятся на ее поверхности. Среди последних групп существенны остатки Лиз, число которых велико — оно равно 19. Очевидно, что определенное расположение зарядов на поверхности моле­кулы важно как для фиксированной структуры глобулы, так и для электростатических взаимодействий с оксидазой и редукта - 80Й Химические исследования показали, что взаимодействие цит с с охсидазой действительно имеет электростатический харак­тер, причем положительные заряды расположены на цит с, ц отрицательные — на комплексе. Блокировка заряда Лиз 13, на­ходящегося на правой части молекулы, сильно уменьшает это взаимодействие. Положительные заряды на другой стороне мо­лекулы, по-видимому, взаимодействуют с редуктазой. В этой об­ласти находятся и три ароматических остатка: Фен 62, Тир 74 и Тир 67.

Таким образом, молекула цит с представляет собой упорядо­ченную систему, молекулярную машину, предназначенную для переноса электрона в результате определенного взаимодействия с оксидазой и редуктазой.

Пока нет прямой информации о том, как эта машина рабо­тает, что происходит при транспорте электронов с составляю­щими ее элементами. Из общих представлений об электронно - конформационных взаимодействиях (см. § 6.6) следует, что функциональность цит с определяется конформационными пе­рестройками молекулы при переходе из окисленного в восста­новленное состояние и обратно. Это подтверждается химиче­скими исследованиями [102, 103], дающими, однако, ограничен­ную информацию.

В работе [100] проведено рентгенографическое исследование восстановленного цит с из сердца тунца с разрешением до 2,45 А. Результаты этого исследования сопоставлены с данными для окисленного цит с. Таким образом, установлены структуры для двух конечных состояний окисления и восстановления цито­хрома с.

Структура глобулы окисленного цит с тождественна для ло­шади и рыб — бонито и тунца. Кристаллы для всех цит с изо­морфны, они относятся к пространственной группе Р43.

Напротив, восстановленные цит с рыб бонито и тунца не изо­морфны, их пространственные группы соответственно P2i2i2i [101] и P2[2i2 [100].

Сравнение полученных структур восстановленного и окислен­ного цитохромов с показывает, что в целом они похожи. В обоих случаях гем погружен в полость молекулы, его ковалентные связи с белком одни и те же. Сходно и расположение водород­ных связей.

Полость, в которой расположен гем, образована слева остат­ками 80—84, задняя стенка полости состоит из боковых цепей Иле 9 и Иле 85 и Лей 68 и 94. Иле 81 находится на краю поло­сти. Вблизи гема расположено 7 «критических» ароматических остатков, сохраняющихся в эволюции. На дне полости находится пара Тир 48 —Фен/Тир 46, справа пара Фен 10 —Тир/Фен 94 и между гемом и поверхностью молекулы триплет Тир/Фен 74 — Трп 59 — Тир/Фен 67. Инвариантен также остаток Фен 82.

Майер и Пал изучали влияние последовательной модифика­ции метионинов, тирозилов и триптофанилов N-бромсукциними - дом (БСИ) при рН 4,1 [105, 106]. При отношении БСИ : белок до 3,3 : 1 Мет 65 и Трп 59 окисляются. При отношении 5 : 1 разру­шается и Тир 74. При этих химических изменениях резко падает редуктазная активность НАД-Н-цитохрома с, и ее падение про­порционально доле окисленного Трп 59. Одновременно происхо­дит более медленное падение оксидазной активности цитохро - ма с. Если отношение БСИ : белок более 5 : 1, происходит моди­фикация второго (не идентифицированного) Тир и окисление Мет 80, что приводит к потере оксидазной активности.

Эти результаты показывают, что Трп 59, по-видимому, уча­ствует в восстановлении цит с. Исходя из этого и из предвари­тельных данных рентгеноструктурного анализа, Дикерсон и Уинфилд предложили модельный механизм восстановления цит с, состоящий в следующем [101].

Один электрон каким-то способом переносится от редук - тазы на Тир 74 и вследствие перекрывания я-электронных обла­ков с Тир 74 на Трп 59. Если избыточный электрон попал на Тир 74, он спонтанно мигрирует на Трп, так как более протяженная кольцевая система делокализации Трп обладает более низкой антисвязывающей орбиталью, которую может занять электрон.

Другой электрон переносится с Тир 67 на гем, оставляя Тир 67 с нехваткой электрона. Здесь также электрон переходит с меньшей системы делокализации на большую, обладающую бо­лее низкими уровнями энергии. Этому переходу способствует электростатическое отталкивание, создаваемое избыточным от­рицательным зарядом на Трп 59, хотя прямой переход электрона с Трп 59 на Тир 67 невозможен вследствие отсутствия перекры­вания я-электронных облаков.

Происходит конформационное изменение, в результате ко­торого кольца Трп 59 и Тир 67 устанавливаются параллельно и их я-облака перекрываются. Этому превращению способствует электростатическое притяжение обогащенного электроном Трп 59 и имеющего нехватку электрона Тир 67.

Электрон затем переносится с Трп 59 на Тир 67, обе груп­пы становятся электрически нейтральными, и молекула остается в наблюдаемой конформации восстановленного цитохрома с. Последний электронный перенос облегчается малой диэлектри­ческой проницаемостью внутренней гидрофобной молекулы.

Редфилд и Гупта [107] установили методом ЯМР, что в окис­ленном цитохроме с неспаренный спин гема проводит большую часть времени на пиррольном кольце, связанном с Цис 17, и на противоположном кольце по диагонали, погребенном в глубине кармана. Это последнее пиррольное кольцо находится в тесном контакте с Тир 67. Спаривание электронов в этой части порфи - ринового кольца должно способствовать переносу электрона с Тир 67 на гем.

Данные об участии ароматических соединений в восстановле­нии гемина (окисленного гема) были получены путем изучения дисперсии магнитного вращения (ДМВ) (см. [3], § 7.3, 7.4) в мо­дельных системах [108]. ДМВ гемина в безводном пиридине практически довпадает с ДМВ феррокомплекса гема с пириди­ном. При добавлении воды ДМВ резко изменяется и становится сходной с ДМВ гемина. По-видимому, в отсутствие воды возни­кают я-комплексы гемина с пиридином. Такие комплексы гемина с сопряженными молекулами в неполярных растворах хорошо изучены, причем показано, что это комплексы с переносом за­ряда [109]. Сходство ДМВ комплекса гемин — пиридин и комп­лекса гем — пиридин показывает, что пиридин служит донором электрона, переходящего на гемин. Из этих результатов следует, что в я-комплексе порфиринового кольца и ароматической моле­кулы (пиридина) происходит перенос электрона и для данного процесса существенна неполярность растворителя, стабилизи­рующего я-комплекс. Переход электрона должен, очевидно, про­исходить с понижением энергии, т. е. от менее протяженной я - электронной системы пиридина К более протяженной СИСТЄіМЄ гема.

Укажем попутно, что исследование дисперсии магнитного вращения и магнитного кругового дихроизма (МКД) цитохро - мов очень перспективно для изучения процессов, происходящих в ЦПЭ. Соответствующие работы начаты лишь недавно. Кривые ДМВ и МКД, полученные для взвеси субмитохондриальных ча­стиц, содержат ярко выраженные пики, отвечающие отдельным цитохромам [110]. Обычные спектры поглощения не дают такой ясной картины.

Модель Дикерсона — Уинфилда очень привлекательна — она непосредственно изображает электронно-конформационные взаи­модействия. К сожалению, пришлось от этой модели отказаться (см. [117]). Последующие результаты рентгеноструктурного ана­лиза не выявляют заметных различий между структурами окис­ленного и восстановленного цит с. Найден цит с, в котором Тир 74 заменен на Лей при полном сохранении активности фер­мента. Поэтому Дикерсон приходит к выводу о туннельном ме­ханизме переноса электрона в цитохроме.

В работах [94—97] предложена модельная квантовомехани- ческая теория ферментативного катализа и изложено ее приме­нение к процессу восстановление — окисление цит с. Показано, в частности, значительное ускорение процесса при наличии про­межуточных электронных состояний системы, взаимодействую­щих как с начальными, так и с конечными состояниями. Реак­ции переноса заряда, такие как Fe3+ Fe2+, сильно ускоряются в присутствии третьей частицы, играющей роль «мостика» для переноса электрона. Функция виртуального мостика рассмотрена в случае цит с, причем получены грубые оценки скорости про­цесса и зависимости ее от температуры, согласные с опытом.

Таким образом, имеются различные предположения о меха­низме переноса электрона в цитохроме с. Решение этой проб­лемы требует, с одной стороны, экспериментального исследова­ния динамики окисления — восстановления, с другой — построе­ния полной квантовомеханической теории процесса, учитываю­щей и электронные и конформационные степени свободы. Мы встречаемся здесь с очень большими трудностями.