ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Биоэнергетические процессы, приводящие к синтезу АТФ, к зарядке «биологических аккумуляторов», протекают в специали­зированных мембранах митохондрий. Именно здесь локализо­ваны и пространственно организованы молекулярные системы, ответственные за энергетику живых организмов. Синтез АТФ в митохондриях сопряжен с электронным и ионным транспортом и с механохимическими явлениями. Функции митохондриальных мембран весьма сложны и многообразны. Другой тип биоэнерге­тических сопрягающих мембран — мембраны хлоропластов рас­тений, ответственные за фотосинтез, — рассматривается в гл.7.

Источником энергии, расходуемой клеткой на биосинтез, ак­тивный транспорт, механическую и электрическую работу, яв­ляется дыхание, т. е. окисление органических соединений кисло­родом воздуха. В 1780 г. Лавуазье показал, что дыхание и горе­ние имеют единую природу. За последующие почти два столетия исследования химиков, биологов и физиков привели к раскры­тию основных особенностей биологического окисления — одного из важнейших процессов (или, скорее, системы процессов), про­исходящих в живой природе.

Топливо, т. е. окисляемые вещества, поступает в организм животного с пищей в виде жиров, углеводов и белков. Жиры представляют собой триглицериды жирных кислот, главным об­разом многоатомных. Они расщепляются, т. е. гидролизуются в реакциях, катализируемых специальными ферментами. Жирные кислоты активируются с участием специфических ферментов и АТФ, превращаясь в ацилпроизводные так называемого кофер - мента А, Ко А — SH, структура которого показана на рис. 6.1. Окисление ацилпроизводного Ко А — SH происходит в ряде стадий, на каждой из которых образуется остаток жирной кис­лоты, содержащий на два атома углерода меньше, чем преды­дущий [1, 2]. Полное уравнение реакции окисления жирной кис­лоты с четным числом атомов углерода до ацетил-S — Ко А имеет вид

Н3С(СН2СН2)„С02Н + АТФ + (п + 1) КоА - SH + лНАД+ +

+ пЕ ■ ФАД + лН20 —>- (п + 1 )CH3COS - КоА +

+ (£5ф + £фч) + "НАД-Н + пЕ - ФАД-Н +

Здесь НАД — кофермент никотинамидадениндинуклеотид (рис.

6.2), Е — фермент, ФАД— кофермент флавинадениндинуклеотид

F.

G он сн, о о щ 1 |

И І і 4 и в „ \ , J;

HS—СН^СН^-МН—G—СН^-СН2—НН—С—СН-С—СН^-О—Р-0—Р-0—CHj, q N^X^/

Сн? о - О" К))

Ат-п

О он он

Рис. 6.1. Кофермент А.

TOC \o "1-3" \h \z (рис. 6.3), АДФ и АМФ — аденозиндифосфат и аденозинмоно - фосфат, Фн, ФФН — неорганические моно - и дифосфаты. Обратим внимание попутно на общность и

Строения АТФ, КоА—SH, НАД и Н В

ФАД (см. [3], гл. 2). При разруше - /\ / \

Нии жиров в конечном счете обра - н| 9 NH2

Зуется ацетил-КоА, а также про - п ^

ПИОНИЛ-КО А И ГЛИЦерИН. - g_p_Q_QH

Расщепление и окисление угле - і | |

Водов (в частности, крахмала) при - \ С^н н^С водит к образованию триозофосфа - і |>с«исг I NH

Тов и пировиноградной кислоты I н L L н I 2

(пирувата). н°-рГ° 0Н 0Н „ /ч

При разрушении белков, наряду / С N

С индивидуальными аминокислота - \ НСч J I

Ми, используемыми в синтезе бел - СН2 0 \

Ков de novo, образуются ацетил - N

Ко А, оксалацетат, а-кетоглутарат, INc^c/I

Фумарат и сукцинат. Эти процессы н і і н

Метаболизма детально изучены в он ОН

Современной биохимии (см. [1,2]). Рис. в-2- Никотинамидаденин-

Основные продукты расщепле - динуклеотид (НАД),

Ния и окисления жиров, углеводов

И белков претерпевают дальнейшие превращения в цикличе­ской системе реакций, именуемой циклом лимонной кислоты или циклом Кребса. Эта система локализована в митохондриях. Цикл Кребса, «образно говоря, та главная ось, вокруг которой вертится метаболизм почти всех существующих клеток... Цикл

Кребса является «фокусом», в котором сходятся все метаболи­ческие пути» [1].

Цикл Кребса изображен на рис. 6.4. За один оборот цикла, состоящего из восьми реакций, отмеченных на рисунке цифрами в кружках, происходит деградация одной молекулы ацетил-КоА

NH. I г

ЛД

?н Т Т Її < 5 L

Н2с—СН—СН—СН—СН,—О-Р-О-Р-О-СН, n-^Ч

III I N'

Н3С X 1 м л 0н °Н С^ Ъ

VVVY М-М

II I I I 1 1

A/\A/NH он он

Н, С V N С s Н II

О

Рис. 6.3. Флавииадениндинуклеотид (ФАД).

Или одной молекулы пиру вата до С02 и Н20, т. е. «сгорание» этих молекул. Соответствующие суммарные реакции имеют вид

CH, COS - КоА + З НАЦ+ + (ФАД) + ГДФ + Ф„ + 2 Н20 —►

—► 2 С02 + КоА — SH + З НАД-Н + (ФАД-Н) + ГТФ + ЗН+, Пируват" + КоА — SH + НАД+ —* CH3COS - КоА + НАД-Н+ + Н+ + С02.

(Скобки обозначают, что ФАД тесно связан с белком.)

От цикла Кребса идут пути многих биосиитетических реак­ций— пути синтеза углеводов, липидов, пуринов, пиримидииов и порфирннов. Синтез белков также связан с циклом, в котором создаются предшественники ряда аминокислот. Вместе с тем, как мы увидим, биологическое окисление является источником энергии, запасаемой в АТФ и необходимой для биосинтетических процессов.

В реакциях цикла возникают С02 и ионы Н+. Одновременно происходит восстановление коферментов НАД и ФАД. Для не­прерывного и полного биологического окисления эти кофермеи - ты должны окисляться вновь. Окисление осуществляется сово­купностью переносчиков электронов, образующих цепь переноса электронов (ЦПЭ), фиксированную в митохондриях. ЦПЭ обес­печивает следующие реакции:

З НАД-Н + 1,5 02 + ЗН+ з НАД+ + 3 Н20 - 3 • 52,4 ккал/моль,

(ФАД-Н) + 0,5 О, —► (ФАД) + Н20 — 36,2 ккал/моль.

Реакция ацетил-КоА имеет вид

CH3COS - КоА + 2 02 -> 2 С02 + Н20 + КоА - SH - 215,2 ккал/моль.

ЦПЭ, иначе именуемая дыхательной цепью, представляет собой

Углеводы-*- CH-CDC07 п

3 2 0 S-KoA

Кислоты

ПируВат у Жирные

KQA-SH-»\ СН

К. 3 >

У v4*- 'Ацетил-КоК С02 2Н ■

А.

^ с=о (Т) г«

KoA-SH

Фн Сущинил-Ш KoA_SH Рис. 6.4. Цикл Кребса.

'2

Тре-'ЪА.-изоцитрац

2

А-кетоглутарапі

Щ їо! аКу

НО-СН С02 fiOj (2)

' СН2 Оксалацетат Цитрат

2 \

FQ) l-тлат \ Vz

Полиферментную систему, акцептирующую электроны из цикла Кребса и цикла окисления жирных кислот.

Электрон переносится по следующей цепи [1, 2, 4]: Сукцинат —► ФП3 1

Субстрат —*■ НАД —»- ФП0 —>■ Цитохром Ь —>- —*■ Цитохром С) —»• Цитохром с —»- Цитохромы а + аз —*■ 02.

Флавопротеиды — специфические ферменты, содержащие флави- новые коферменты—ФАД (см. рис. 6.3) и флавинмононуклео - тид ФМН, рибофлавин-5'-фосфат. Цитохромы содержат группу гема, атом железа которого при работе цепи подвергается окис­лению и восстановлению:

Fe2+ Fe3+ - f e~.

Перенос электронов в приведенной цепи происходит слева на­право, завершаясь восстановлением кислорода, который соеди­няется с водородом и образует воду. Освобождаемый при окис­лении электрон соединяется со следующим звеном цепи. Перенос электронов сопровождается изменением свободной энергии, так как электроны перемещаются по каскаду возрастающих окисли­тельно-восстановительных потенциалов. Их значения приведены в табл. 6.1 [1].

Таблица 6.1

Окислительно-восстановительные потенциалы некоторых систем

Перенос электронов по дыхательной цепи сопряжен с запа­санием энергии в макроэргических молекулах АТФ. Иными сло­вами, освобождаемая свободная энергия конвертируется в хи­мическую энергию АТФ. Происходит окислительное фосфорили - рование.

Это важнейшее явление было впервые открыто Энгельгард - том в 1930 г. [5]. Белицер и Цыбакова [6] подробно изучили стехиометрические соотношения между окислением и фосфори - лированием, провели первые определения коэффициента Фн О. т. е. отношения числа молекул этерифицированного неорганиче­
ского фосфата к числу атомов поглощенного кислорода, и по­казали, что значение этого коэффициента не менее 2. В работе [6] были даны термодинамические оценки, показавшие, что энер­гия переноса электронов на кислород достаточна для образова­ния двух или большего числа молекул АТФ на один атом по­глощенного кислорода. Калькар установил, что аэробное фосфо - рилирование сопряжено с дыханием и не зависит от гликолити - ческого фосфорилирования [7]. Количественные соотношения были уточнены Очоа [8]. Коэффициент Фн: О для окислительных реакций цикла Кребса и реакций с участием НАД равен 3. Ленинджер впервые установил, что процессы окислительного фосфорилирования локализованы именно в митохондриях [4, 9,

АТФ \ АТФ АТФ

НАД—ФП,—KoQ—>-^/77 Ь-~-цит ь-^-цит с—-цит - 02 Глутамат ' 1

З-онсиацил-У&к

КоА - произВодное жирной кислоты

Глицеродюс/рат

Рис. 6.5. Дыхательная цепь [1,2].

Прямые стрелки показывают места вхождения электронов. ФП,. ФП,, ...—флавопротеиды.

KoQ — кофермент Q.

10], и в работах его лаборатории были найдены узловые пункты дыхательной цепи, в которых происходит фосфорилирование. Указанное значение Фн : О следует из уравнения

НАД-Н + Н+ + З АДФ + 3 Ф„ + V2O2 —► НАД+ + 4 Н20 + 3 АТФ. В этом уравнении суммируются экзергоническая реакция НАД-Н + Н+ + V2O2 —> НАД+ + Н20 + 52,7 ккал/моль

И эндергоническая реакция

3 АДФ + 3 Фн —>■ З АТФ + 3 Н20 — 21,9 ккал/моль.

Фосфорилирование АДФ -> АТФ происходит в трех узловых пунктах — в участке цепи НАД-Н —► флавопротеид, в участке цитохром Ь цитохром сі и в участке цитохром с -* цитохромы а + а3.

Общая схема сопряжения окисления с фосфорилированием приведена на рис. 6.5.

Напишем вновь брутто-уравнение фосфорилирования

ПируВат^ Сущинагп

АДФ + H2P04" - f Н+ +=± АТФ + HgO — ДО,

Где AG — изменение свободной энергии. Имеем

TOC \o "1-3" \h \z [адф] Гн, ро:1 [н+] , >4

AG = AG" + RT ІП. (6.1)

AG0 — стандартное изменение свободной энергии в калориях, т. е. значение AG при рН 7,0, 25°С и концентрациях всех компо­нентов, равных 1,0 М. Как известно,

AG0 = - RT In К, (6.2)

где К — константа равновесия реакции. Для фосфорилирования AG0 = 7,3 ккал/моль. Наблюдаемое значение AG in vivo зависит от концентрации протонов по обе стороны мембраны и, следо­вательно, от мембранной разности потенциалов. AG зависит так­же от концентрации ионов Mg++. При изменении рН от 6,0 до 9,0 при [Mg++] = 10 мМ AG меняется от 6,17 до 9,29 ккал/моль (см. [79, 113]).

Изменение свободной энергии при переносе двух электронных эквивалентов по ЦПЭ от НАД-Н к 02 определяется разностью окислительно-восстановительных потенциалов 0,82 — (—0,32) = = 1,14 В, т. е.

AG0 = z Д-ф = — 2 • 23,06 -1,14 ккал/моль = — 52,7 ккал/моль.

Это обеспечивает с избытком синтез 3 молей АТФ из АДФ и Фн. Эффективность процесса выражается величиной 21,9/52,7, т. е. примерно равна 40%.

Энергетический смысл дыхания состоит в синтезе АТФ. Энер­гия, аккумулированная в АТФ, используется клеткой для выпол­нения всех видов ее работы.

Раскрытие химизма биологического окисления — крупнейшее достижение биохимии. Здесь изложены лишь некоторые важней­шие сведения, подробное рассмотрение сложной биохимической системы окисления содержится в специальной литературе (см. [1—3, 11—13]).

Особенность системы окислительного фосфорилирования, от­личающая ее от ряда ферментативных реакций, протекающих в растворе, состоит в строгой пространственной локализации зве­ньев многоступенчатого процесса. Окислительное фосфорилиро - вание локализовано в митохондриях и непосредственно связано с транспортной и механохимической функциональностью их мембран. По-видимому, столь сложная система биохимических реакций принципиально требует пространственной неоднородно­сти и не могла бы реализоваться в гомогенной среде.

Расшифровка кратко описанных здесь окислительно-восста­новительных реакций была получена в результате применения тонких химических и физических методов. Здесь, в частности,
сыграли большую роль работы Чаиса, посвященные спектроско­пии переносчиков электронов (НАД, ФП, цитохромов) в интакт - ных митохондриях. Эти переносчики обладают характерными полосами поглощения в видимой и близкой ультрафиолетовой областях спектра, и разностные спектры позволяют изучать ки­нетику их окисления и восстановления [14]. Были применены различные способы удаления из митохондрий специфических ферментов н. тем самым, сохранения лишь определенных звеньев

НАД-Н

ГІП

(Fe-Fe)

\

KoQ \

І—(FB-FBV і

Ж

ПІ

KoQ ♦

(Fe-Fe) II t

Ш

Сутщншп

Рис. 6.6. Распределение белков по комплексам ЦПЭ І, II, III, IV.

А, Ь, с. Сі, йі— >нтохромы, Си — медьсодержащие белкн, (Fe —be) —негемнновое железо, fs — сукцинатдегидрогеназа, iq—НАД Н-дегидрогеназа.

Процесса. Митохондрии подвергались расчленению, из субмито- хондриальных частиц выделялись комплексы дыхательных фер­ментов, свободные от структурных белков. Такие комплексы оказалось возможным очищать и детально исследовать. Были проведены успешные опыты по восстановлению ЦПЭ из выде­ленных препаратов и растворимых ферментов. Наконец, очень ценная информация была получена в опытах по ингибированию отдельных стадий процесса и по разобщению окислительного фосфорилирования и переноса электронов (см. § 6.5).

Можно считать установленным, что переносчики ЦПЭ сгруп­пированы в четыре комплекса, именуемые комплексами Грина (см. [15]). Соответствующая схема приведена на рис. 6.6. Моле­кулярный вес каждого комплекса равен примерно 3-Ю5 Он со­держит около 64% белка и 36% липидов. Электрон-переносящий
комплекс определяется как минимальная единица ЦПЭ, сохра­няющая способность переносить электрон со скоростью, сравни­мой с этой скоростью в интактных митохондриях.

Изучение биологического окисления встречается с необходи­мостью решения ряда физических проблем, относящихся к раз­личным уровням организации и функционирования системы.

Структура и функции молекулярных переносчиков электро­нов изучены еще недостаточно. В § 6.7 рассмотрены современ­ные данные, относящиеся к строению и свойствам цитохрома с. Цитохром с исследовался очень детально, но его динамические свойства нельзя считать полностью установленными и объяснен­ными.

Строение и функциональная организация митохондрий яви­лись предметом интенсивного изучения. Тем не менее, многие важнейшие вопросы, сюда относящиеся, пока не имеют ответа. Специфическая мембранная структура мигохондрий, присутствие в них автономной программы синтеза белков (ДНК), механохи - мическая активность митохондрий непосредственно связаны с их ролью «силовых станций» клетки. Дальнейшее развитие физики митохондрий требует целостного подхода.

Общая теория электронного транспорта в локализованной системе биологического окисления интенсивно развивается. Предложены содержательные кинетические модели, начаты тео­ретические исследования, основанные на рассмотрении элект - ронно-конформационных взаимодействий. Эти проблемы пред­ставляют первостепенный интерес для биофизики.

Необходимо установить молекулярную природу биологиче­ского окисления, осуществляемого в результате сопряжения фер­ментативных, транспортных и механохимических процессов. Ми­тохондрия есть место интегрирования широкой совокупности мо - лекулярно-биологических явлений, целостная система, требую­щая всестороннего изучения — теоретической и эксперименталь­ной разборки и сборки «черного ящика».