Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Определение констант расщепления в нулевом поле

Мы уже видели, что одно из характерных свойств высоко­спиновых производных гемоглобина и миоглобина — очень боль­шое расщепление энергетических уровней под действием внутрен­него молекулярного поля. Именно это расщепление обусловливает высокое значение g* , равное 6,0 (фиг. 98). Очевидно, что вели­чина расщепления и механизм его возникновения непосредственно зависят от характера связи самого атома железа. Поэтому было предпринято несколько попыток определить это расщепление с возможно большей точностью, используя самые разнообразные производные миоглобина и гемоглобина, чтобы получить целост­ную картину структуры энергетических уровней гема — цен­тральной части молекулы этих веществ.

Можно себе представить два способа измерения константы расщепления/). Во-первых, ее можно определить непосредственно, индуцируя (если это возможно) переход между одним из двух уровней основного состояния и одним из уровней более высоко лежащей компоненты, характеризующейся спином Ms — ±3/г (вертикальные стрелки на фиг. 98). Как уже отмечалось, энергия кванта микроволнового излучения с длиной волны 3 см (обычная длина волны, используемая в ЭПР-спектроскопии) и даже 8 мм недостаточна, чтобы вызвать такой переход. Именно поэтому сейчас получают все большее распространение спектрометры, работающие на длинах волн 4 и 2 мм. Возможность работать на таких длинах волн и создавать сильные магнитные поля с помощью сверхпроводящих магнитов позволит, по-видимому, наблюдать переходы между уровнями +V2 и ±3/2 и, следова­тельно, непосредственно определять значение константы расще­пления. В этом направлении уже получены некоторые предвари­тельные результаты [26].

Можно, однако, вполне точно оценить константу расщепле­ния D и косвенным способом, регистрируя изменения g* при все более и более высоких микроволновых частотах. При низких микроволновых частотах и, следовательно, при низких (по срав­нению с D) энергиях кванта величина g^® =6,0, но по м«?ре возрастания частоты это значение уменьшается [уравнение (6.5)j. При микроволновой частоте порядка 72 000 МГц (длина волны 4 мм) и выше величина gJM> сильно отклоняется от значения 6.0 (см. фиг. 98), что дает возмоншость очень точно определить вели­чину D.

Этот анализ на самом деле не столь прост, как может показаться на основании уравнения (6.5), поскольку изменение g-фактора в плоскости гема не совсем изотропно. Помимо аксиальной ком­поненты расщепления D существует также ромбическая компо­нента Е. Эта ромбическая компонента вызывает анизотропию g, в результате чего Gx и Gv несколько отличаются друг от друга (как у окисленных производных, так и у азидов). Для определе­ния констант Е и Е этим методом было проведено множество экспериментов на различных производных миоглобина и гемогло­бина с ионной связью.

Айзенбергер и Першан [27] первыми применили этот метод (измерение отклонения f^ от 6,0) для расчета D. Они провели тщательные измерения на частотах 13 000 и 35 000 МГц, но в своих] расчетах не учитывали ромбической компоненты Е Полученные ими значения g; М' на этих частотах были равны 5,960 и 5,930 соответственно, откуда 2D = 8.76 см-1. Котани и Моримото [25], продолживпГие? эти исследования, измеряли анизотропию в плоскости гема и его отклонение от 6.0 Полученное ими значен ние D было равно 10.0 см"1 для окисленного миоглобина и 6,5 см 1 для фторпроизводного миоглобина; на этом основании они пред­положили, что Е составляет около 4% от D. Однако, поскольку эти эксперименты^выполнялись при относительно низких микро­волновых частотах околоЙ9000 МГц, надо думать, что ошибка при определении!) была довольно велика. Ингрэмц^Слэйд [14, 28], работая на длин|е волны 4 мм, получили Значительно большие сдвиги g':,|)J, lJ — до 5,915. В результате тщательной обработки этих данных для окисленного гемоглобина были получены значе-J ния 22А=4(8 8 ± 0,8) см В настоящее время проводятся даль­нейшие исследования (на других производных и в широком диапа зоне температур), на основе которых можно будет выяснить детали влияния внутреннего электростатического поля.

Эттмсследования отчетливо показали, что для полного выясне­ния общей картины системы энергетических уровней атома железа совместно с его лигандным окружением потребуется еще немалая работа по изучению спектров ЭПР различных производных мио­глобина и гемоглобина. Но вместе с тем уже сейчас ясно, что этот метод является мощным орудием для установления деталей струк­туры!)! гема и конфигурации его молекулярных орбиталей.