Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Методы усреднения (накопления)

За последние годы в исследовании очень слабых сигналов ЭПР произошел коренной переворот, связанный с появлением методов усреднения и интегрирования. Их главная ценность для ЭПР-спек - троскопии состоит в том, что они позволяют исследовать быстро изменяющиеся спектры — обстоятельство, особенно важное при изучении биохимических реакций. Однако идея и способы приме­нения этих методов будут более понятны, если мы начнем с самого простого случая и рассмотрим, как с их помощью можно повысить чувствительность спектрометра для статического ЭПР-сигнала; лишь после этого мы перейдем к более сложному случаю быстро изменяющихся спектров и, наконец, к нестационарным процессам.

Чтобы пояснить сущность метода, рассмотрим сигнал, замаски­рованный шумом (фиг. 27, А). Если такой сигнал записывать с обычной постоянной времени, равной 10 с, то самописец зафик­сирует только беспорядочные шумы. Основной принцип метода усреднения заключается в многократном повторении замаскиро­ванного шумом сигнала, причем результат каждого прохождения отсылается в накопительное устройство, где он суммируется со всеми хранящимися там предыдущими сигналами. Схематически это показано на фиг. 27, Б, где ось Н разделена на большое число малых интервалов. По мере прохождения магнитным полем каж­дого из этих интервалов соответствующий сигнал с выхода спек­трометра последовательно подается в различные накопительные каналы. Так, когда магнитное поле достигает определенного значения между точками а и Ъ спектра, сигнал с выхода спектро­метра подается в канал между А и В в накопительном устройстве. Таким образом, если весь спектр разделен по полю на 100 интер­валов, в записывающем устройстве должно быть 100 каналов для накопления сигналов, получаемых поочередно при каждом значении поля.

Если таким способом записывается только однократное про­хождение магнитного поля, форма зарегистрированного сигнала, разумеется, не будет ничем отличаться от приведенной на фиг. 27, Л и сигнал будет полностью скрыт под шумами. Если эту операцию повторить второй раз, величина выходного напряжения спектро­метра, подаваемого в каждый накопительный канал, будет снова

Осцшша, т ф

Ими ссм' писец

Нпкшшпельные

С

Б

Фиг. 27. Увеличение отношения сигнал/шум с помощью накопления.

А — типичный сигнал, : амаскированпый шумом детектора (результат однократного прохождения спектра) Б — деление диапазона развертки магнитного по^я на малые интервалы, свячаниые каждый с сочтветствуюш-м накопительный каналом,

Определяться уровнем интенсивности сигнала (которая будет той же самой, что и при первом прохождении) плюс значение шума в каждый данный момент. Аналогично при третьем и четвертом прохождениях на вход каждого канала будет подаваться напря­жение, состоящей из сигнала поглощения при данном значении поля и соответствующего уровня шума. Но в то время как вели­чина накопленного сигнала, соответствующего резонансному поглощению, будет расти линейно с числом прохождений п,
Результирующий шум будет пропорционален Уп (так как значе­ние шума при каждом отдельном прохождении является случай­ной величиной и не зависит от уровня шума при других прохожде­ниях). Следовательно, по мере увеличения числа прохождений отношение сигнал/шум будет расти пропорционально г п. В результате сигнал поглощения выделяется из шума; присоеди­нив выход накопительного устройства к осциллографу или само­писцу, можно видеть, как при достаточном количестве прохожде­ний сигнал становится различимым на фоне шума.

Любая интегрирующая система такого рода должна включать два основных компонента. Первый — это соответствующее нако­пительное устройство, второй — синхронизирующее устройство, необходимое для того, чтобы развертка магнитного поля при каждом прохождении начиналась с одной и той же исходной точки и последовательные накопительные каналы открывались точно в нужные моменты. На начальном этапе развития техники нако­пления было испытано множество различных накопительных устройств, в частности магнитные ленты и фотокатодные трубки. Однако настоящее развитие этих методов началось после того, как Клейн и Бартон [4] показали, что в качестве накопительного устройства можно с успехом использовать специальную цифровую вычислительную машину — накопитель. В каждом из множества каналов памяти этой машины может храниться любое число от 0 до Ю4. Так как в этом устройстве хранятся числа, а не напря-

А спектр ионов марганца (разбавленный водный раствор): 1 — одно прохождение,

11 5000 прохождений. Б — спектр типичного органического свободного радикала

(разбавленный раствор): I—IV — 1, 10, 100 и 2500 прохождений соответственно.

Жения, между выходом ЭПР-спектрометра и входом накопитель­ных каналов помещают преобразователь, превращающий выход­ное напряжение спектрометра, которое служит мерой интенсив­ности сигнала поглощения (плюс шум), в пропорциональное ему число (частоту). Соответствующая схема показана на фиг. 28.

По мере прохождения спектра ЭПР (посредством изменения магнитного поля) выходное напряжение спектрометра с помощью синхронизирующего устройства последовательно подается в раз­личные накопительные каналы. Числа, поступающие в каждый канал, прямо пропорциональны интенсивности выходного сиг­нала спектрометра в каждый конкретный момент. Весь процесс повторяется необходимое число раз, и с каждым разом отношение сигнала к шуму в накопительном устройстве увеличивается. Эффективность метода усреднения можно оценить, обратившись к фиг. 29. На фиг. 29, А изображен спектр, полученный Клейном и Бартоном [4] для водного раствора, содержащего небольшое количество ионов марганца. Такой спектр, как уже отмечалось, часто наблюдается в биохимических исследованиях. После одного прохождения никаких линий поглощения вообще не видно, тогда как после 5000 прохождений выявляется совершенно четкий сигнал, а шум почти полностью исчезает. На фиг. 29, Б показан сигнал ЭПР свободного радикала, выделенный из шума тем же способом. Здесь можно ясно видеть последовательное увеличение отношения сигнала к шуму и даже проследить его количествен­ную зависимость от ]/п.

Использование накопителей для усреднения и интегрирования таких статических сигналов оказалось настолько эффективным, что в настоящее время они приняты почти повсеместно в качестве необходимого дополнения к любому высокочувствительному ЭПР - спектрометру.