Электронный Парамагнитный резонанс в биологии
Метод непрерывного потока
На фиг. 33 изображена общая конструкция прибора для исследований в непрерывном потоке, разработанная Пьеттом [5я Брэем [6] и др. Два исходных раствора находятся в шприцах, расположенных в верхней части прибора; шприцы различаются ме. кду
|
Фиг. 33. Конструкция прибора для измерений в непрерывном потоке. — : идравличе( >,ий пресс, в — раствор фермента 3 — раствор субстрата й — и arpei "" ~*ная рубана а; 5 - шгриа для фермента (: 00 мл), 6 — шприц для субстрат» (10 'ил); 7 — смесительная камера; 8—прям! угольная ю арцевая. рубка ('1,5 мм х X 9 мм), 9 — резонатор;' 10 - приемный "щриц, 11 - чыпускное отверстие |
|
Фиг. 34. Спектры ЭПР, полученные методом непрерывного потока. |
|
Б |
|
А — образование радикала семихинона в присутствии пероксидазы. Во всех случаях через резонатор пропускались растворы 10-2 M гидрохинона и Ю-2 М H2Oz со скоростью 8 мл/с. 1 —пероксидаза отсутствует; II — пероксидаза в концентрации 4-10-8 M; III пероксидаза в концентрации 1 ■ Ю-8 М; В— кривая спада концентрации свободных радикалов аскорбиновой кислоты [5]. Спектрометр настраивали на максимум поглощения и затем прерывали поток реагентов, после чего можно было непосредственно зарегистрировать ход изменения концентрации радикалов во времени. Смесительной камерой и резонатором, менять скорость движения поршней в сосудах, а следовательно, и скорость движения реакционной смеси по выходной трубке. При этом вдоль трубки будут создаваться динамические концентрации короткоживущих продуктов, причем концентрация парамагнитных промежуточных |
Собой по площади поперечного сечения и емкости, так как реагенты должны смешиваться в неравных количествах. Поршни в обоих шприцах движутся вниз с одинаковой скоростью, что обеспечивает соблюдение требуемых пропорций при перемешивание растворов. В смесительной камере имеется большое число тончайших жиклеров, которые обеспечивают создание турбулентных потоков и быстрое перемешивание двух растворов сразу же после их поступления в камеру. Из камеры вниз идет кварцевая выходная ■рубка, проходящая через полость резонатора, расстояние которого до смесительной камеры можно менять. Другая возможность г.< «стоит в том, чтобы, сохраняя фиксированным расстояние между
А
Продуктов будет величиной, постояипой для каждой данной точки выходной трубки, пока поршни будут двигаться внргз С одной и той же скоростью. Таким образом, для детектирования и воспроизведения такого сигнала можно использовать довольно большую постоянную времени и тем самым сильно повысить чувствительность. Быстрое изменение сигнала во времени переводится здесь в изменение по длине выходной трубки. Примеры спектров, полученных с помощью таких приборов, приведены на фиг. 34; можно видеть, что таким способом обнаруживаются достаточно малые концентрации парамагнитных центров, даже если эти центры принадлежат быстро изменяющимся нестационарным продуктам.
Большой недостаток описанной системы состоит в том, что она требует больших количеств исследуемого материала. Если же экспериментатор располагает лишь относительно малыми количествами (как это и бывает в большинстве случаев при биохимических исследованиях), то необходимо модифицировать метод, таким образом, чтобы максимально использовать весь материал, проходящий через систему. Это можно сделать с помощью метода, описанного ниже.
