Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования медьсодержащих ферментов

Методом ЭПР было выполнено большое число исследований на ферментах, в состав которых входят атомы меди. Эти ферменты представляют большой интерес с точки зрения биохимии. Хорошо разрешенная сверхтонкая структура спектров ЭПР, обусловленная ионами меди, дает немало интересной информации относительно природы химической связи атомов меди. Вопрос о том, каким образом на основании измеренных величин g-фактора и сверх­тонкого расщепления может быть установлена картина химических связей и выяснены детали молекулярной структуры, более под­робно будет рассмотрен в следующей главе; в разд. 6.4 будет показано, что методом ЭПР были получены точные сведения отно­сительно координации и характера связей атомов меди в таких медьсодержащих ферментах, как церулоплазмин.

Церулоплазмин представляет собой окрашенный в голубой цвет белок с молекулярным весом 160 ООО, содержащий 8 атомов меди на молекулу. Дифференциальный химический анализ показал [30], что более 36% входящей в состав фермента меди находится в двухвалентном состоянии и что, по всей вероятности, подобные медьсодержащие белки содержат равные количества одно - и двух­валентной меди. Подробный анализ величин g фактора и сверх­тонкого расщепления, наблюдаемого в спектрах ЭПР церулоплаз - мина (разд. 6.4), свидетельствует о том, что существуют различные типы связей между четырьмя ионами двухвалентной меди. Но инте­ресно, что обычные кинетич-зские исследования таких ферментов также позволяют выяснись, в какой степени различные валентные состояния меди участвуют в процессе ферментативной активности,

Так, например, неоднократно делались попытки обнаружит!, связь между голубым окрашиванием фермента, его ферментативной активностью и характером спектра ЭПР. Броман и др. [31] пока­зали, что наблюдаемое при инкубации фермента исчезновение поглощения при 610 им, ферментативная активность и амплитуде одной из ЭПР-линий, расположенных в области низких полей, тесно связаны между собой. С помощью того же метода Блум- бергу и др. [32] удалось продемонстрировать, что существует линейная зависимость между интегральной интенсивностью ЭПР - поглощения и исчезновением поглощения при 610 нм при восста­новлении фермента аскорбатом.

Таким образом, становится очевидным, что медь не только играет определенную роль в процессе ферментативного катализа, но, по всей вероятности, обусловливает также и голубое окраши­вание белка, возникающее либо в результате взаимодействия ато мов одно - и двухвалентной меди, либо в результате переходов с переносом заряда от азота к меди.

Много исследований с применением метода ЭПР было проведено и на другом медьсодержащем ферменте — цитохромоксидазе Цитохромы — это весьма важная группа веществ, участвующих в заключительных этапах окисления. Подобно каталазе и перокси дазе, цитохромы содержат в своем составе гем. Как показали раз­нообразные фотохимические исследования, железо гема принимает участие в самом процессе окисления. Были получены также дан­ные [33], свидетельствующие о том, ч"0 в процессе биосинтеза питохромоксидазы, помимо атомов железа гема, участвует и медь Цитохромоксидаза представляет собой фермент, катализирующий последний этап процесса биологического окисления: с ее помощью осуществляется окисление восстановленных форм цьтохромов молекулярным кислородом. После того как была освоена методика получения очищенных препаратов цитохромоксидазы, был про­веден подробный химический анализ этого фермента, который показал, что на молекулу гема в ферменте прих Ьдш ся определен­ное количество меди, находящейся, как предполагалось вначале, в одновалентном состоянии. Вместе с тем результаты некоторых экспериментов свидетельствовали о том, что иногда медь может присутствовать в двухвалентной форме. Более определенные све­дения об истинной роли меди в цитохромоксидазных реакциях удалось получить только после того, как были проведены иссле­дования методом ЭПР.

Спектр ЭПР, который дают атомы меди в цитохромоксидазе, обладает некоторыми особенностями, позволяющими судить о характере связей меди внутри молекулы [34, 35]. Так, значения g-фактора (gк = 2,17 и GL = 2,03) оказываются значительно более близкими к значению g-фактора свободного электрона, чем у меди, входящей в состав других медьсодержащих белков. Это означает, что должна существовать очень сильная ковалентная связь между атомами меди и другими лигандами [поскольку такое сильное уменьшение анизотропии g-фактора соответствует значительному уменьшению константы а2 в уравнении (5.1) и, следовательно, очень высокой степени ковалентности (гл. 6)]. О том же свидетель­ствует отсутствие заметного сверхтонкого расщепления около положения g||; если опо и существует, то величина его крайне незначительна, что служит дополнительным доказательством высо­кой степени делокализации неспаренного электрона атома меди. Спектр меди ЭПР был также тщательно исследован релаксацион­ными методами [36] (гл. 7). Сначала считали, что полученные результаты свидетельствуют о сильном обменном взаимодействии между парами атомов меди, так как использование высоких уров­ней микроволновой мощности при 93 К не приводило к появлению эффектов насыщения. Однако более поздние эксперименты, прове­денные при температуре жидкого гелия, показали, что при этой температуре насыщение наступает при низкой мощности, и, сле­довательно, сильное обменное взаимодействие между атомами меди маловероятно.

Был также проведен ряд экспериментов по кинетике цитохром- оксидазной реакции и кинетике сигнала ЭПР иона меди. Эти исследования, коротко говоря, подтвердили, что медь, обнаружи­ваемая в цитохромоксидазе, является составной частью фермента и способна претерпевать быстрые окислительно-восстановительные превращения в ходе ферментативпого процесса. Вместе с тем очевидно, что потребуется еще немало времени и труда для опре­деления характера связей атомов меди в этой молекуле и выясне­ния вопроса о том, существует ли какое-либо взаимодействие между медью и гемом.

Можно видеть, что в выяснение механизма действия цитохром - оксидазы метод ЭПР уже внес немалый вклад, и можно надеяться что в будущем этот вклад станет еще большим. Рассмотрением этого важного фермента мы и закончим главу, посвященную применению метода ЭПР в энзимологии. Структура и механизм действия большинства ферментов крайне сложны и лишь в очень немногих случаях зыяснены окончательно. Поэтсму исследования этих соединений открывают широкие перспективы для применения метода ЭПР, и мы надеемся, что приведенные нами примеры доста­точно ясно показывают, каким образом его можно использовать для исследования кинетики и механизма ферментативной актив­ности и для выяснения характера связи между активными ионами металлов и остальной частью белковой молекулы.

Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Направление будущих исследовании

Описанные в этой главе исследования находятся еще на самой начальной, предварительной стадии, и о многих возможностях использования в биологии таких методов, как ДЭЯР и спин - метка, мы еще, конечно, …

Метод спин-меток

В разд. 7.1 уже упоминалось о том, что метод спин-меток был специально разработан для исследований биологических молекул. Этим он отличается от всех других методов ЭПР-спектроскопии, которые были разработаны ранее и …

Применение метода ДЭЯР

Вопрос о том, каким образом принцгп и. технику метода ДЭЯР,', описанные в разд. 3.8 и. 3.9, можно приложить к исследованию биохимических систем, лучше всего, по-видимому, рассмотреть на примере экспериментов с …

Как с нами связаться:

Украина:
г.Александрия
тел./факс +38 05235  77193 Бухгалтерия
+38 050 512 11 94 — гл. инженер-менеджер (продажи всего оборудования)

+38 050 457 13 30 — Рашид - продажи новинок
e-mail: msd@msd.com.ua
Схема проезда к производственному офису:
Схема проезда к МСД

Оперативная связь

Укажите свой телефон или адрес эл. почты — наш менеджер перезвонит Вам в удобное для Вас время.