Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Исследования фотосинтеза методом ЭПР

В течение последних нескольких лет механизм фотосинтеза исследовался очень интенсивно с использованием целого ряда самых различных методов. Как только исследователи поняли, что может дать применение метода ЭПР в биологии и биохимии, его стали широко использовать для изучения процесса фотосинтеза.

Первые работы в этой области были выполнены Коммонером, ченсом и Таунсендом [31] и Сого с сотр. [32]. Коммонер и его сотрудники подвергали зеленые листья лиофилизации и получен­ный таким образом материал помещали в резонатор спектрометра. Ясно, что на таких образцах проведение кинетических исследова­ний было невозможно. Тем не менее эти начальные эксперименты отчетливо показали, что существует значительное различие в содержании неспаренных электронов в зависимости от того, выращиваются ли растения в нормальных условиях освещения или

Фиг. 65. Содержание неспаренных электронов и интенсивность процесса

Фотоспитеза [31].

Кривые показывают изменение концентрации неспаренных электронов в листьях ячменя при разных условиях освещения. А — проростки, выращенные при нормальном осве­щении; Б — выращенные в темноте; В — выращенные в темноте и освещавшиеся затем в течение 6 ч; Г — выращенные в темноте и освещавшиеся затем в течение 24 ч.

В отсутствие света (фиг. 65). Это дало основание предположить, что существует определенная корреляция между содержанием неспаренных электронов в образце и процессом фотосинтеза.

В дальнейших экспериментах, предпринятых обеими группами исследователей, водные растворы хлоропластов исследовали in situ в резонаторе при различных условиях освещения. Именно для этих целей были впервые сконструированы специальные кюветы для исследования водных образцов. Результаты такого рода экспериментов показали, что в отсутствие освещения концентра­ция неспаренных электронов в образце очень незначительна, но при освещении его светом большой интенсивности она увеличивается более чем в 6 раз. Наблюдаемые сигналы ЭПР не обладали сверх­тонкой структурой и характеризовались шириной линии около 10 Э, что соответствовало величинам, получаемым в то время для сигналов других метаболически активных тканей.

Затем на тех же объектах были проведены кинетические иссле­дования, в которых скорости изменения концентрации свободных радикалов измерялись при помощи регистрирующей аппаратуры с достаточно высоким быстродействием. Было найдено, что после включения света концентрация неспаренных электронов экспонен­циально растет до определенного стационарного значения с посто­янной времени порядка 12 с. Это совпадает с результатами других кинетических исследований процесса фотосинтеза и дает основание

Термопара медь-константан

Фиг. 66. Схема резонатора и спектрометра, применявшихся в первых иссле­дованиях фотосинтеза методом ЭПР [32]. Раствор хлоропдастов наносился на'поверхность покрытого серебром медного стержня, проходящего через кварцевый дьюар, и нижний конец стержня погружали в баню, тем­пературу которой можно было наменять.

Предполагать наличие тесной взаимосвязи между процессом фото­синтеза и обнаруживаемыми неспаренными электронами. В даль­нейшем были также проведены эксперименты [33] при различных температурных условиях с использованием резонатора, показан­ного на фиг. 66.

Изучение кинетики сигнала ЭПР на таком спектрометре пока­зало, что время роста сигнала, по-видимому, мало зависит от тем­пературы образца, даже если она изменяется в диапазоне от тем­пературы жидкого азота до комнатной. Однако время затухания Сигнала очень сильно зависит от температуры и при понижении ее до значений, близких к температуре жидкого азота, увеличи­
вается, как правило, на несколько порядков. Независимость роста сигнала от температуры позволяет, по-видимому, исключить те механизмы фотосинтеза, в которых предполагается, что кон­центрация неспаренных электронов непосредственно связана с химическими реакциями или триплетными возбужденными состо­яниями. Судя по значительному увеличению времени затухания при понижении температуры, обнаруживаемые неспаренные элек­троны должны находиться в каких-то энергетических ловушках. При комнатной яге температуре величина тепловой энергии оказы­вается достаточной для того, чтобы относительно легко выбить электроны из этих ловушек.

Дальнейшие измерения с применением спектрометров, дающих высокое разрешение [65], показали, что сигнал ЭПР состоит из двух компонент. Одна из них, центру которой соответствует g-фактор, равный 2,002, не обладает сверхтонкой структурой и наблюдается лишь непосредственно после освещения; эта ком­понента характеризуется высокими скоростями роста и затухания. Другая компонента, с центром при G = 2,005, состоит из пяти сверхтонких линий и наблюдается иногда в темноте; время ее роста и затухания много больше, чем у первой компоненты. По-видимому, первая компонента обусловливается неспаренными электронами, непосредственно участвующими в процессе фотосин­теза, а вторая обязана своим происхождением какому-то проме­жуточному свободнорадикальному соединению, возникающему в ходе окислительно-восстановительных превращений.

Описанные экспериментальные данные и сделанные из них выводы наводят на мысль, что неспаренные электроны, наблю­даемые в фотосинтетических реакциях, связаны с низкоэнергети­ческими ловушками, располагающимися несколько ниже первого возбужденного состояния, и, по всей вероятности, являются обя­зательными участниками процесса фотосинтеза. Для полного выяс­нения всего этого механизма необходимо, конечно, тщательно сравнить результаты ЭПР-измерений с данными, полученными другими методами. Но следует все же отметить, что и в этом случае метод ЭПР позволяет проникнуть в интимные механизмы одного из самых важных процессов, протекающих в живой природе.