Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

ЭПР и канцерогенная активность

В предыдущем разделе было показано, что методом ЭПР обна­руживаются высокие концентрации неспаренных электронов в не­которых веществах, обладающих канцерогенной активностью [52j, и это дает основание предполагать, что она так или иначе свя­зана с присутствием неспаренных электронов. Хотя эти предва­рительные эксперименты не дали материала для построения ка­кой-либо развернутой гипотезы о механизме канцерогенеза, они послужили толчком для возникновения ряда интересных пред­положений, связывающих канцерогенную активность с конкрет­ной электронной конфигурацией молекулярных орбиталей иссле­дуемых молекул.

Такой подход на электронном уровне к объяснению механизма канцерогенеза впервые предложили А. Пюльман и Б. Пюльман [53]. исходившие из той же теории, которую Хюккель [2] раньше применил к более простым молекулам, обсуждаишимся выше в разд. 4.2. Они постулировали, что взаимодействие канцеро­генных ароматических углеводородов с компонентами клетки осу­ществляется через некоторые специфические участки углеводо­рода и может иметь место лишь при условии, что в образовании связей между углеводородом и клеточными структурами прини­мают участие делокалнзованные л-электроны молекулы углево­дорода. В результате некоторые из этих связей оказываются двой­ными и общее электронное облако углеводорода приобретает хиноидную конфигурацию. Достоинство этой теории состоит в том, что она приложима ко всем углеводородным молекулам;

Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные [54] указывают на то, что связи между углеводородом и живой тканью действительно имеют хиноидкую природу.

Представления А Пюльманда Б. Пюльмана [55] относительно того, какие ароматические углеводороды должны обладать кап! церогенной активностью и какие — нет, иллюстрирует фиг. 75, где обозначены два участка ароматической «олекулы — К-область и L-область. Согласно теории ПюльманаЛканцерогенньши свой ствами обладают такие молекулы, в которых имеется химически

Активная К область (активная ароматическая связь)- iij отсут­ствует активная L-область (активные пара-Положения). Химиче­ская активность этих двух участков может быть выражена коли­чественно через «энергию локализации»*которая в свою очередь измеряет энергию ^активации химических реакций, протекающих на этих участках. Таким образом, эта теория получает прямое количественное обоснование. Установленные количественные соот­ношения позволяют объяснить, за очень небольшим исключением, канцерогенную активность (или инертность) всех исследованных полибензольных углеводородов

Истинное пороговое значение «энергии локализации» лучше всего выражать количественно в единицах обменного интеграла р (величины, получающейся прш расчетезЬаолекулярных орбита - лей). В теории Пюльмана утверждается, что необходимым усло­вием. канцерогенности углеводорода является наличие в нем К-области с энергетическизк индексом менее 3,31 р. Если же в моле­куле имеется еще и I-участок, то она будет канцерогенной лиш» в том случае, если индекс этого участка будет больше 5,66(5.

Типичный пример использования этой теории при рассмотрении ^'конкретных молекул' приведен на фиг. 76, где изображены раз­личные производные антрацена. На фиг. 76,А представлена струк­турная формула самого антрацена и указаны соответствующие
значения активности К - и L-областей, выраженных через обмен­ный интеграл. Можно видеть, что в молекуле антрацона индекс К-области больше чем 3,31, а индекс L-области меньше чем 5,66, поэтому эта молекула не канцерогенна. На фиг. 76,Б пока­зана молекула нафтацена, образующаяся при линейном при­соединении к молекуле антрацена одного добавочного бензоль­ного кольца. В этой молекуле ни один из индексов для областей К и L также не удовлетворяет условию канцерогенной активности.

Фиг. 76. Энергетические индексы для различных углеводородов [55].

А — антрацен; Б — нафтацен; В — 1,2-бензантрацен; Г — 1,2,5,6-дибензантрацен;

Д — 3,4-бепзпмрен.

Если, однако, добавочное кольцо присоединяется не линейно, а в боковое положение, как у 1,2-бензантрацена (фиг. 76,В), то индекс К -области становится меньше критической величины 3,31. Индекс L-области здесь возрастает, но не настолько, чтобы до­стигнуть критического значения 5,66, хотя очевидно, что добав­ление нового кольца в это положение способствует превращению молекулы в канцерогенную форму. Бензантрацен можно класси­фицировать как «пограничный канцероген».

Если в боковое положение добавляется второе бензольное кольцо (1,2,5,6-дибензантрацен; фиг. 76,Г), то индекс L-области увеличивается до 5,69, т. е. существенно превышает критическое
значение, а индекс К-области сохраняет еще значение ниже 3,31. Следовательно, в этой молекуле выполняются оба условия кан­церогенное™; экспериментально обнаружено, что она действи­тельно обладаетшчандепогенньшч свойствами. Нужно помнить, что в этой теории значение молекулярного орбитального обмен­ного интеграла для L-области имеет смысл только при наличии такого участка в молекуле. В,,;этом отношении интересен случай, представленный на фиг. 76,Д где креходной молекуле антра­цена присоединено еще одно добавочное бензольное Кольцо в таком положении, что L-участок полностью блокируется. Таким обра­зом, это вещество (3,4-бензпирен) удовлетворяет первому усло­вию, т. е. имеет очень активный К-участок, индекс которого суще­ственно ниже 3,31, но совсем не имеет L-участка. Кз этого сльдует, что оно должно быть сильным канцерогеном; экспериментально показано, что это действительно так. Можно привести много по­добных примеров, и почти всегда наблюдается хорошая корреля­ция между теорией и экспериментально наблюдаемой канцеро­генно® активностью.

Следует подчеркнуть, что в этой теории измеряемые ^индексы относятся к обменным интегралам обычных молекулярных орби - талей спаренных электронов, а не орбиталей неспаренных элек­тронов, как в стабильных радикалах (разд. 4.2). Таким образом, в этих молекулах совсем необязательно должны содержаться неспаренные электроны. Но в отсутствие неспаренных электро­нов они не будут парамагнитными и, следовательно, их нельзя будет обнаружить методом ЭПР. Большинство экспериментов с применением метода ЭПР [56, 68] действительно свидетельствует о том, что никакой закономерности в соотношении между содер­жанием неспаренных электронов в молекуле и ее. канцероген - ностью не существует.

С другой стороны, были выдвинуты гипотезы, состоящие в том, что некоторые виды канцерогенной активности могут быть ^обу­словлены более специфическими механизмами реакции, напри­мер переносом электрона 'или возбужденного состояния между ароматическими молекулами и биохимическими клеточными ре­цепторами. Так, согласно гипотезе Мэзона [57], .капцетюгышая активность проявляется в тех случаях, когда существует воз­можность электронных переходов с верхней'заполненной полосы системы энергетических уровней белка на один из незаполнен­ных уровней связанного с ним углеводорода. Для того чтобы такой переход имел место, незаполненный уровень углеводорода должен соответствовать по энергии высшему заполненному уровню самого белка (фиг. 77). Предполагается, что в результате пере­хода электрона с белка на углеводород в системе энергетических полос белка появляется неспаренный электрон, который и обу­словливает канцерогенную активность.

Углеводород

Пустая полос а

Пустые уровни

Заполненная полоса

Высший

Заполненный

Уровень

Заполненная полоса А

Таким образом, ключевым моментом в этой теории является соответствие двух систем энергетичесвдх уровней. Разница в энер­гии в системе энергетических полос белка'Измеряется величинами порядка от 1,10 до 1,18 единиц р (резонансный обменный интеграл в теории молекулярных орбиталей). Таким образом, для под­тверждения правомерности этой теории существует простой и пря - моп^тест: нужно проверить, Имеется ли какая-либо определенная зависимость между канцерогенной активностью углеводородов и шириной запрещенных зон в их системах энергетических уров­ней. К сожалению, по этому вопросу существуют серьезные раз­ногласия, и хотя сам Мэзон [57] утверждает, что получи®! экспе­риментальное подтверждение своей теории, другие авторы, на­пример Пюльманы [58], показали, что такой связи не наблю­дается.

Были предприняты попытки проверить эту теорию, используя другой критерий, а именно прчмые измерения ЭПР-поглощения [59] В этой серии экспериментов исследовались сами белки (в отсутствие углеводородов); их облучали ультрафиолетом раз­личных длин волн, чтобы более прямым методом опредечить пере­ходы между энергетическими уровнями белка. ЭПР^-йзмерения проводились не только с разными длинами вслн, но и при разной температуре; эти опыты показали, что при облучении ультрафиоле­том, энергия которого соответствует критической величине запре­щенной зоны, действительно возникают значительные концентра­ции неспаренных электронов. Вместе с тем стало ясно, что обна­руживаемые неспаренные электроны находятся не на самом высшем уровне, а попадают в ловушки на каких-то более низких уровнях, лежащих ниже основной полосы. Эти уровни, таким образом, можно рассматривать как аналоги примесных уровней в обычном неорганическом полупроводнике. Приведенные выше результаты ЭПР-измерений послужили убедительным доказа­тельством правильности теории полупроводниковых проводящих полос в применении к белкам. Но поскольку ключевым моментом в теории М;;зона [57] являлась связь между канцерогенностью углеводородов и структурой их энергетических уровней, эти экспе­рименты с применением* ЭПР не смогли дать каких-либо опреде­ленных доказательств ни в пользу, ни против этой теории.

Другая теория, предложенная Бёрксом, [60], состоит в том, что злокачественный рост под действием сопряженных углеводо­родов обусловлен резонансным переходом энергии возбуждения с триптофана на канцерогенный углеводород с'последующим обра­зованием специфического комплекса белок — канцероген. Таким образом, в этой теории предполагается, что механизм малигниза - ции основан на диполь-дипольном переносе энергии, а не на пере­носе самого электрона. Основны® параметром в теории Бёркса является, следовательно, значение интеграла перекрывания, соот­ветствующего первому возбужденному сннглетному состоянию углеводорода. При экспериментальной проверке этой теории так­же возникли разногласия. Бёркс и его сотрудники [60, 61] утверж­дают, что существует отчетливая зависимость между канцероген­ной активностью углеводородов и величиной их интеграла пере­крывания, но, по мнению Пюльмана [62], на самом деле такой зависимости не наблюдается и, следовательно, эта теория не под­тверждается экспериментально.

То обстоятельство, что теории Мэзона и Бёркса были постав­лены под сомнение, вовсе не означает, что процесс переноса элек­трона не играет никакой роли в механизме канцерогенеза. Не­давно Сент-Дьёрдьи с сотр. [63] показал, что многие канцерогены образуют с иодом комплексы с переносом заряда. Больше того, теоретические выкладки Пюльмана можно также интерпретиро­вать с другой точки зрения, имея в виду распределение плотности заряда па молекуле канцерогена и, следовательно, способность канцерогена отдавать заряды на определенных участках своей молекулы. Следует также отметить, что были получены и некото­рые положительные результаты по электронному парамагнитному резонансу. В ряде комплексов с переносом заряда, в том числе в комплексах с индолом и с иодом, наблюдались сигналы ЭПР. В частности, Элисон и Нэш [64] изучали комплексы, образован­ные различными капцерогенами (или соответствующими некан­церогенными молекулами) и тетрацианэтиленом, взятыми в экви - молярном соотношешш. Образцы помещались в стеклянные труб­ки в атмосфере азота, и трубки запаивались. Измерения прово­дились на.;100-кГц ЭПР-спектрометре при длине волны 3,2 см в условиях комнатной температуры. Полученные результаты приведены в табл. 2, где вещества расположены в порядке воз­растания их донорной активности. При анализе этих результатов становится совершенно очевидным, что концентрация неспарен-

Пых электронов, наблюдаемая в таких комплексах, возрастает пропорционально д опорной! активности исследуемых молекул,

В заключение следует заметить, что в настоящее время имеются веские доводы, как подтверждающие роль электронно-акцептор­ных и электронно-донорных взаимодействий в механизме канце­рогенеза, так и опровергающие эту точку зрения. Но, каким бы пи был исход споров относительно механизма канцерогенеза, нет сомнения в том, что экспериментальные данные, полученные мето­дом ЭПР, окажут очень большую помощь в установлении более определенных и точных фактов, ча которых могут быть основаны и проверены обе теории.