Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Более поздние эксперименты

При дальнейшем изучении спектров ЭПР облученных белков и аминокислот Горди и Курита [7] попытались выяснить действи­тельный механизм образования свободных радикалов и проследить за судьбой первичных и вторичных продуктов радиационного поражения. Полученные результаты подтвердили в общих чертах ранние работы Горди и др. [5]: стало ясно, что при облучении белков в вакууме при комнатной температуре наблюдаются сиг­налы двух основных типов — во-первых, хорошо разрешенный дублет, подобный тому, который наблюдался у шелка-сырца, и, во-вторых, широкий сигнал порядка 100 Э (при использовании длин волн Х-диапазона), соответствующий спектру, приписывае­мому, как уже было показано в предыдущей главе, атомам серы.

Для более тщательной проверки последнего предположения Горди и Курита [7] изучали подвергнутые - у-облучению монокри­сталлы цистиндигидрохлорида с целью точного измерения смеще­ния g-фактора. При произвольном выборе направления магнитного поля наблюдалось два дублета (фиг. 55), которые сливались, когда магнитное поле было направлено вдоль кристаллографической оси Ъ или лежало в плоскости ас. Это означает, что оба дублета обусловлены одним и тем же свободным радикалом, по-разному ориентированным относительно осей кристалла. Кроме того, из фиг. 55 видно, что расщепление внутри каждого дублета не зависит от микроволновой частоты и, следовательно, вызывается сверхтонким взаимодействием, тогда как расстояние между дубле­тами зависит от частоты (при 23 ГГц оно значительно больше, чем при 9 ГГц). Таким образом, эти резонансные линии свидетель­ствуют о значительном сдвиге величины g'-фактора.

Резонансные значения поля, соответствующие двум сверхтон­ким компонентам этих двух дублетов при разных ориентг. циях магнитного поля в плоскости Ъс, представлены на фиг. 56 (изме­рения проводились при 9 ГГц; за нуль отсчета было принято резонансное значение магнитного поля, соответствующее g-фактору свободного электрона). Мояшо видеть, что экспериментальные

Точки (обозначены кружками) хорошо укладываются на теорети­ческие кривые. На основании этих измерений (а также измерений в других кристаллографических плоскостях) Горди и Курита [7] заключили, что g-фактор для этих радикалов имеет следующие три основных значения: g-, "д^2,003. Gv = 2,029 и Gz = 2,052.

Такую сильную анизотропию g-фактора можно объяснить тем, что под действием подающего у-излучения разрывается S — S-связь в молекуле цистина и освобождается неспаренный электрон, который остается локализованным в значительной сте­пени на атоме S. В пользу этого предположения говорит тот факт, что при облучении образуются два различно ориентированных радикала, хотя все исходные молекулы ориентированы одинаково. Если бы наблюдаемый резонанс был обусловлен трехэлектронной S — S-связыо, как предполагалось сначала, все свободные радика­лы должны были бы иметь одну и ту же ориентацию. Разрыв же этой связи приводит к образованию двух фрагментов, которые могут ориентироваться по-разному.

Такую интерпретацию подтверждает также анализ сверхтонкой структуры. Для того чтобы установить, чем вызвано расщенление дублета — атомом водорода, связанным с углеродом, или же атомом водорода, связанным с кислородом или азотом,— этот спектр был сопоставлен со спектрами дейтерированных образцов. Изве­стно, что атомы дейтерия замещают только протоны, связанные

С кислородом или азотом, но не с углеродом. Так как никакого видимого изменения спектров при дейтерировании не наблюдалось, был сделан вывод, что протон, участвующий во взаимодействии, связан с углеродным атомом. Из этого следует, что волновая функция неспаренного электрона, локализованного в основном на атоме серы, перекрывается, по-видимому, с волновой функцией протонов соседней СН2-группы (сверхсопряжение), в результате чего и возникает наблюдаемый дублет с расщеплением около 10 Э.

Конечная ориентация образующегося свободного радикала пока­зана на фиг. 57.

Мы подробно проанализировали эти частные результаты потому, что они ясно показывают, насколько полезнее исследовать моно­кристаллы, чем pt створы (если, конечно, исследуемое вещество можно получить в виде монокристалла); эти результаты позволяют сделать окончательный вывод о причине значительного смещения '/-фактора, наблюдаемого у многих облученных белков,

Если смещение g-фактора для монокристалла известно, то мож­но предсказать форму линии и для поликристаллического образца,

А Б

Фиг. 57. Изменение ориентации сьободных радикалов, образовавшихся в цистиндигидрохлориде под действием у -облучения [7].

— структурная формула^деповрежденной мстскулы; Б — структурная формул; свс бодно: J радикала с измененной орлеитацией. разрыв связи Sit - S позволяет атому серы певемес иться вниз налево (соответственно изменяются положения атомов Нi и Н2).

Содержащего те же свободные радикалы, но ориентированные беспорядочно относительно направления внешнего магнитного поля. Такой теоретический расчет был проведен в общем виде Кнёбелем [8]. В конкретном случае кристаллов цистиндигидро - хлорида среднее значение g-фактора получается равным 2,028. Таким образом, данные экспериментальных исследований на моно­кристаллах и их экстраполяция на поликристаллические препа­раты подтверждают, что главной отличительной чертой свободных радикалов, образующихся при у-облучении с-ерусодержащих бел­ков, действительно является локализация неспаренного электрона на атомах серы (но, по-видимому, не на трехэлектронной S — S-связи, как предполагалось вначале).

В тот А^е период был выполнен ряд работ по выяснению при­роды сверхтонкого расщепления в дублете, которое наблюдается при рентгеновском облучении дипептидов и полипептидов. Аиали-
зируя свои более поздние работы, Горди с сотр. [9] предположили, чтоу£тот дублет] обусловлен локализацией неспаренного электрона на каком-то одном протоне, находящемся в остове белковой моле­кулы, а не взаимодействием с протоном, осуществляющим попереч­ную водородную связь, как предполагалось ранее. При исследо­вании поликристаллического или аморфного материала всегда трудно однозначно интерпретировать спектры ЭПР. Как было пока­зано для случая цистичдигидрохлорида, при изучении монокри­сталлов можно получить значи­тельно более определенную и специфическую информацию.

К настоящему времени ис­следованы монокристаллы мало­новой [10], янтарной [11] и глу таминовой кислот, глицина [12, 13] и сМ-алашша 114]. Группа

Горди продолжает проводить систематические исс ледов анчя монокристаллов белков и амино­кислот, входящих в их состав. Сравнение этих спектров и тео­ретический прогноз их струк­туры при усреднении всех веро­ятных направлений дают осно-

Цепи и что эти радикалы, по всей вероятности, образуются на всех аминокислотных остатках при отрыве боковой цепи. Хенриксен и др. [15] высказали пред­положение, что неспаренный электрон локализуется на остатке глицина, поскольку в этом случае для образования свободного радикала должен> произойти отрыв только одного атома водо­рода.

Результаты всех этих исследований можно резюмировать сле­дующим образом. Конечным результатом рентгеновского облуче­ния белков является образование радикалов типов I и II (фиг. 58) В серусодержащих белках образуются радикалы тина I, для которых характерно смещение g-фактора, обусловленное взаимо­действием с атомом серы; при прямом взаимодействии протона с неспаренным электроном, локализованным на белковом остове, образуются радикалы типа II, спектр которых имеет вид дублета. Исследования полиаминокислот [16], подвергнутых рентгевовскому облучению, показывают, что в этих случаях иногда образуются радикалы двух других типов — III и IV

По-видимому, радикалы типа III возникают также и при рент­геновском облучении белков, тогда как доказательства существо­вания радикалов типа IV получены только на аминокислотах. Результаты подробных исследований Паттена и Горди [9] на эту тему сведены в табл. 1.

Таблица 1

Типы радикалов, образующихся при рентгеновском облучении [9J

Спектр, обусловленный радикалом типа III (нолн-Z-алаиип), представлен на фиг. 59 (там же для сравнения показан более часто встречающийся дублетный спектр). Так как в радикале поли-Z - аланина неспаренный электрон должен взаимодействовать с тремя эквивалентными протонами метильной группы, при облучении, как и следовало ожидать, появляется квартетное сверхтонкое рас­щепление.

Для проверхш высказанного выше предположения о происхож­дении этих свободнорадикальных сигналов и сигналов, наблю­даемых в экспериментах на белках, было проведено прямое сравне­ние сигналов, полученных на самих белках, с сигналами, получае­мыми на смесях аминокислот, взятых в тех же пропорциях, что
и в данном белке. Эти исследования Паттен и Горди [17] прово­дили в строго контролируемых условиях температуры и давления - Аналогичные исследования провели на фибриллярных белках Полит с сотр. [18], которые изучали смеси твердых растворов раз­личных аминокислот.

К настоящему моменту эти исследования достигли уже такой стадии, когда для многих белков можно определить вероятное

Место и локализацию неспа­ренного электрона и сво- боднорадикальной актив­ности.

Таким образом, несмот­ря на то, что эти спектры, полученные на твердых веществах, состоят из ши­роких линий, трудных для: идентификации и анализа, такого рода исследования могут дать весьма значи­тельное количество инфор­мации. Эти результаты можно сравнить с недав­ними работами Рейса и Уайта [19], которые ис­пользовали третированный сероводород для «перех­вата» свободных радика­лов, образующихся в дан­ных условиях облучения, и таким образом опреде­ляли их распределение вдоль углеродной цепи. Эти эксперименты пока­зали, что возникновение свободных радикалов мо - по-видимому, происходить на различных аминокислотных остатках, входящих в состав белковой цепи, и что, вероятно, доля свободных радикалов, образующихся на глицине, совсем не так высока, как предполагалось вначале на основании анализа ЭПР-спектров.