Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Анализ сверхтонкой структуры

Вопрос о том, как возникает сверхтонкое расщепление, уже обсуждался в разд. 1.5 и 4.1. В частности, отмечалось, что спектры со сверхтонкой структурой (фш 11), состоящей'из (21 4- 1) линий равной интенсивности, получаются в том случае, если песпаренд­ный электрон взаимодействует только с одним ядром, имеющим спин I. В разд. 1.5 рассматривался такжейс случай взаимодей­ствия неспаренного электрона с несколькими ядрами, а именно взаимодействие с п эквивалентными протонами; было показано, что в этом случае наблюдается сверхтонкий спектр, состоящий из (п 4- 1) линий, интенсивности которых распределены по бино­миальному закону

Однако очень часто, особенно в соединениях, представляющих интерес для биологии и биохимии, молекулярная орбиталь неспа­ренного электрона неодинаково связана с разными протонами, окружающими данную молекулярную систему. Наблюдаемая в этих случаях сверхтонкая структура очень слонша, но тем не менее ее можно однозначно интерпретировать, поскольку очень

<4-1182
высокое разрешение, получаемое при исследовании свободных радикалов в растворе, позволяет подробно охарактеризовать спектр СП Р. Чтобы пояснить, каким образом проводится такого рода анализ, обратимся к конкретному примеру.

Ь

|, 73

Mm

Б

Наблюдаемый в растворе 11], а на фиг. 52, В тот же спектр изобра­жен схематически. Можно видеть, что он состоит из семи основных линий с соотношением интенсивностей примерно 1:6: 15 : 20 : : 15 : 6 : 1 и каждая из этих линий в свою очередь расщепляется на квадруплет. Чтобы объяснить возникновение семи основных компонент, следует предположить, что неспаренный электрон характеризуется сильным взаимодействием с шестью симметрично расположенными протонами. Расщепление каждой из этих линий на четыре субкомпоненты указывает на дополнительное более слабое взаимодействие с тремя другими симметрично расположен­ными протонами. Из структурной формулы перинафтена видно» что в этой молекуле действительно имеется группа из шести симмет­ричных протонов (они обозначены буквой а) и группа из трех протонов Ъ, симметричных относительно друг друга, но не относительно протонов а. Соотношение наблюдаемых сверх­тонких расщеплений (7,3 Э для протонов а и 2,2 Э для протонов Ъ) должно служить мерой соотношения спиновых плотностей на про­тонах этих двух типов. Эти экспериментально определенные спи­новые плотности вполне сравнимы со спиновыми плотностями, предсказываемыми теорией молекулярных орбиталей (0,325 и 0,098 для протонов а и Ъ соответственно).

Таким образом, картина сверхтонкого расщепления в спектре ЭПР позволяет найти некоторые количественные характеристики орбитали неспаренного электрона. Более того, активность различ­ных функциональных групп, входящих в состав свободного радика­ла, зачастую оказывается прямо пропорциональной концентрации неспаренных электронов в этих группах, и в таких случаях анализ сверхтонкой структуры может дать непосредственную информацию о специфической активности различных частей молекулы.

Сверхтонкое расщепление, наблюдаемое на свободных радика­лах в растворе, часто бывает значительно более сложным, чем у перхшафтена. В таких случаях первоначальная простая теория, разработанная Хюккелем [2] и другими авторами, оказывается недостаточной и приходится прибегать к очень сложному теоре­тическому анализу. Благодаря тому что техника эксперимента позволяет теперь получать спектры очень высокого разрешения и вместе с тем осуществим подробный расчет спектров того же типа методами теоретической химии, появилась возможность сравнивать наблюдаемые спектры с теоретическими предсказа­ниями. На основе постулированных констант расщепления и пара­метров, характеризующих форму линий, можно предсказать вид спектра, используя электронные вычислительные машины. Пример такого использования ЭВМ приведен на фиг. 53.

На рис. 53, А показан экспериментально наблюдаемый спектр ЭПР катион-радикала бипиридила в растворе, а на фиг. 53, Б — Наилучший вариант расчетного спектра, полученного на ЭВМ.

Параметры расщепления и спиновые плотности, использованные при расчете этого наилучшего варианта, могут быть автоматически считаны с ЭВМ и послужить основой для создания подробного и точного описания молекулярной орбитали.

Такого рода информация на только дает точные сведения о реальной орбитали неспаренного электрона и об активности раз­личных групп, входящих в состав радикала, но и позволяет опре­делить типы химических связей в молекуле. Так, чтобы полностью объяснить этот изотропный спектр, нужно предположить, что какая-то часть неспаренных электронов находится в s-состоянии,

Так как, если бы электроны находились только в р-состоянии, это приводило бы к возникновению анизотропного спектра, кото­рый бы усреднялся из-за беспорядочного движения молекул в растворе. В первом приближении, однако, движение неспарен­ных электронов происходит только по я-орбиталям кольцевой системы, а р-состояния углеродного атома, образующие систему я-связей, не пререкрываются (или не взаимодействуют) непосред­ственно с .S-Coctohhhhmh протонов. Эту кажущуюся аномалию можно объяснить, введя понятие «конфигурационного взаимодей­ствия», означающее, что к основному состоянию молекулы при­мешано небольшое количество более высоких возбужденных состоя­ний. Эти более высокие состояния возникают, когда один электрон из электронной пары, обычно образующей о-связь между углеро­дом и водородом, переводит на разрыхляющую о орбиталь [4, 28] Тогда Электрон, оставпийся на связывающей о-орбитали, стано­вится неспаренным и непосредственно взаимодействует с протоном, поскольку в образовании о связи участвует s-орбита присоединен­ного протона. Результаты проведенных теоретических расчетов механизма конфигурационного взаимодействия такого типа можно теперь сравнить с экспериментально наблюдаемыми параметрами спектров ЭПР, дающими точные сведения о том, какое количество более 'Jilicokhx электронных состояний примешано к основным состояниям этих свободных радикалов. Хотя такого рода информа­ция представляет, вероятно, больший интерес для химиков-теоре - тиков, чем для биохимиков или биологов, в тех случаях, когда речь идет об активности свободных радикалов, она весьма важна. Эта информация, кроме того, имеет существенное значение и для исследований по триплетным возбужденным состояниям (см. ниже), которые имеют особое значение для биологии.

Следует заметить, однако, что в биологии и биохимии анализ сверхтонкой структуры спектров ЭПР применяется пока в основ­ном лишь для идентификации активных групп (см. ниже), и поэто­му мы не будем углубляться в теоретическое рассмотрение этого вопроса.