Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Анализ ширины линии и сверхтонкого расщепления

Ширина линий ЭПР-поглощения, наблюдаемая на монокри­сталлах производных мио - и гемоглобинов, исчисляется несколь­кими сотнями эрстед. Такую большую ширину никак нельзя объяснить обычными процессами уширения. Концентрация атомов железа в этих соединениях крайне невелика, и уширение, вызывае­мое дипольным взаимодействием между ними, не может превосхо­дить нескольких эрстед. Кроме того, в интервале 4—90 К ширина линий не зависит от температуры, что свидетельствует об отсут­ствии значительных эффектов спин-решеточной релаксации. Клю­чом к раскрытию возможных механизмов уширения в этих слу­чаях послужило быстрое изменение ширины линий в зависимости от ориентации, а также сильное сужение линий в направлениях,, соответствующих крайним значениям g-фактора. То обстоятель­ство, что в спектрах этих соединений (особенно окисленных произ­водных) при изменении угла между направлением магнитного поля и нормалью гема g-фактор резко изменяется, говорит о том, что резонансное значение напряженности поля очень чувстви­тельно к изменению этого угла. Следовательно, если бы по той или иной причине направление нормалей гема несколько менялось от молекулы к молекуле, в спектре должен был бы выявиться целый набор резонансных значений напряженности. Более того, угловая зависимость должна быть при этом именно такой, какая наблюдается для ширины линии в спектрах окисленных произ­водных. С целью выяснить, может ли подобная рандомизация ориентаций гемогрупп в кристалле качественно и количественно объяснить наблюдаемые в эксперименте аномально большие значения ширины линий и их угловую зависимость, был проведен подробный теоретический расчет. Для окисленных производных в такой теории требуется рассмотреть только одну переменную — стандартное отклонение величины угла, характеризующее упомя­нутый выше статистический разброс ориентаций нормалей. Такой разброс в ориентацнях приведет к соответствующему разбросу в значениях g-фактора от молекулы к молекуле и, следовательно, к размазыванию линии поглощения. Выражение для ширины линии в этом случае имеет вид [24]

^■■у.'а2 _________________ >

Д# = j, gg"'') sin 2 Gsin 2Д6 + const, (6.7)

Где 0 — угол между приложенным магнитным полем и нормалью к плоскости гема, а Д0 — стандартное отклонение этой величины при беспорядочной ориентации гемогрупп. Первое слагаемое в правой части отражает вклад разброса значений g-фактора, обусловленного беспорядочной ориентацией, а второе представ*- ляет собой константу, включающую прочие механизмы остаточ­ного уширения. Как показывает фиг. 111, это выражение доста­точно хорошо согласуется с данными, полученными эксперимен­тально. Теоретическая кривая на фиг. 111 вычерчена на основании уравнения (6.7) в предположении, что 2Д6 = 0,055 рад, или 3,3°. Следовательно, для объяснения уширения, наблюдаемого в спектре окисленного миоглобина, достаточно предположить, что в ориен­тации гемогрупп существует разброс величиной всего 1,6°.

Хотя уравнение (6.7) позволяет объяснить основные особен­ности уширения линий в спектрах ЭПР гемоглобина и миоглобина, дальнейшие исследования в этой области привели к выводу, что существуют и другие механизмы уширения, природа которых выяснена еще не полностью. Так, систематическое изучение изме­нения ширины линии в зависимости от угла при длине волны 4 мм [14] показывает, что помимо изменения, обусловленного описан­ным выше разбросом значений g-фактора, в спектре имеется также добавочная компонента, непосредственно зависящая от микровол­новой частоты, используемой в спектрометре. Все известные до сих пор механизмы уширения линии не зависят от частоты, и, следовательно, эти результаты свидетельствуют о том, что в таких производных гемоглобина существует механизм нового типа, до сих пор еще не встречавшийся.

Одно из возможных объяснений заключается в том, что в оки­сленном производном имеет место не только разброс ориентаций

Плоскости гема, но и разброс констант расщепления в нулевом поле D, обусловленный непостоянством расстояния гидроксила от атома железа. Такой разброс в величине константы D должен привести в свою очередь к рандомизации эффективного значе­ния g-фактора (уравнение 6.5). Более того, из уравнения (6.5) можно видеть, что получаемое в эксперименте эффективное значе­ние g-фактора зависит от отношения константы расщепления D К частоте используемых микроволн и, следовательно, к напряжен­ности магнитного поля, необходимой для наблюдения резонанса. Таким образом, это один из немногих механизмов, вызывающих добавочное уширение, которое линейно зависит от микроволновой частоты, используемой в спектрометре. Очевидно, что для выясне­ния всех вопросов, связанных с шириной линии в спектрах этих соединений, необходимы дальнейшие исследования. Мы не будем больше останавливаться на этом вопросе, так как приведенные результаты достаточно убедительно показывают, что системати­ческие исследования ширины линии в спектрах ЭПР таких про­изводных нередко могут дать дополнительные сведения относи­тельно внутримолекулярных взаимодействий.

Описанное выше добавочное уширение линий, связанное с беспорядочной ориентацией гемогрупп, лимитирует разрешение в спектрах ЭПР и делает невозможным наблюдение суперсверх­тонкой структуры, обусловленной окружающими атомами азота. Не исключено, что ее удается обнаружить, проводя исследования

На кристаллах при комнатной температуре, так как в этом случае имеет место динамическое обменное сужение линии поглощения. В настоящее время высокое содержание воды в кристаллах еще не! дает возможности проводить такие эксперименты, но они несомненно будут осуществлены в самом ближайшем будущем. Пока сверхтонкое расщепление, обусловленное соседним лиганд- ным атомом, удалось наблюдать только в спектре фторпроизвод­ного миоглобина [25].

Фторпроизводное миоглобина представляет собой соединение, обладающее ионной связью и, следовательно, является высоко­спиновым производным, аналогичным окисленному миоглобину. Поэтому характер изменения g-фактора и общий вид спектров у этого производного очень похожи на то, что наблюдается на окисленном миоглобине. Котани и Моримото [25! удалось получить в этом случае дублетное расщепление, которое можно приписать сверхтонкому взаимодействию с ядром F18, имеющим спин I = V2 (фиг. 112). Эти данные весьма интересны для биохи­миков, так как они ясно показывают, что даже в случае высоко­спиновых производных с ионной связью имеет место значитель­ное перекрывание между неспаренный электроном атома железа и лигандом, находящимся в шестом координационном положении. Дальнейшие исследования сверхтонкого расщепления у соедине­ний, содержащих в этом положении другие группы, дадут, вероятно, более подробные и точные сведения относительно молекулярных орбиталей центрального атома железа.