Соняшник

Опис SGE метода аналізу ізоензимів соняшнику (Helianthus annuus L.)

1. Кількість паростків для експертизи:

- Для перевірки формули:

10 паростків кожної інбредної лінії 4 паростки простих гібридів 10 паростків трилінійних гібридів

- Для експертизи на відмінність, однорідність і стабільність:

не менше 40 паростків для інбредних ліній, гібридів і вільно запилюваних сор­тів.

2. Прилади та обладнання

Будь-яка відповідна горизонтальна електрофорезна система може бути використана за умови, що гелі утримують за температури 40С. Рекомендована товщина гелю 10 мм. Енергію слід використовувати таку, яка здатна підтримувати постійне постачання напруги на виході.

3. Хімікати

Усі хімікати мають бути придатними для хімічних аналізів найвищої якості.

3.1 Хімікати для екстракції ензимів: три - (гідрооксіметил) амінометан (три); соляна кислота;

В- меркаптоетанол.

3.2 Хімікати для електрофорезу: бромфенол синій;

лимонна кислота моногідрат;

L-Гістидин;

крохмаль гідролізований для електрофорезу (Sigma S-4501 або рівноцінний).

3.3 Хімікати для забарвлення ензимів:

95% етанол;

етилендіамін тетра-оцтової кислоти, двонатрієва сіль (EDTA Na2);

D-фруктоза 6-фосфат, двонатрієва сіль;

A-D-Глюкоза 1-фосфат, моногідрат, двонатрієва сіль; глюкоза 6-фосфат дегідрогеназа (Sigma G5885); соляна кислота (HCI); хлорид магнію гексагідрат (MgCI2, 6H2O);

DL-яблучна кислота, натрієва сіль; диметилтіазол діфенол тетразол (МТТ);

В-Нікотинамід аденін дінуклеотид фосфат (NADR); нітро-синій тетразол (NBT);

6-фосфоглюконова кислота, тринатрієва сіль дігідрат;

феназін мета сульфат (PMS);

гідрооксид натрію (NaOH);

три- (гідро метил) амінометан (три).

4. Розчини

4.1 Розчин для екстракції: 0.1М три HCI (pH 7.2) + 0.2%-меркаптоетанол (v/v).

4.2 Буфери для електрофорезу

4.2.1 Буфери для SGE pH 6,5

4.2.1.1 Основний розчин: 0, 364 M L-гістидин лимонний:

50,44г L-гістидин;

8, 34 г моногідрат лимонної кислоти змішати з 1л де-іонізованої води.

4.2.1.2 Текучий буфер: 0,072 M L-гістидин лимонний рН 6.5 (основний розчин розведений 1:5)

400 мл основного розчину (4.2.1.1) змішати з 2л де-іонізованої води.

4.2.1.3 Гелевий буфер: 0,024M L-гістидин лимонний (основний розчин розведений 1:5) 80 мл основного розчину (4.2.1.1)

змішати з 1200 мл де-іонізованої води.

4.2.2 Буфер для SGE рН 5.7

4.2.2.1 Текучий буфер: 0,067 M L-гістидин лимонний рН 5.7 20,18 г L-гістидину

8,34 г Моногідрату лимонної кислоти змішати з 2 л де-іонізованої води.

4.2.2.2 Гелевий буфер: 0, 011 M L-гістидин лимонний (Текучий буфер розведений 1:6) 100 мл текучого буфера (4.2.2.10) змішати з 1200 мл де-іонізованої води.

4.2.2.3 Розчин бромфенолу синього

50 мг бромфенолу синього розчиняють в 100 мл де-іонізованої води.

4.3 Фарбуючі розчини

4.3.1 Основні розчини

4.3.1.1 1М три-HCI pH 7.5:

121.1 г три-HCI, змішати з 1л де-іонізованої води і встановлюють рН 7,5 з 50% HCI.

4.3.1.2 1 М три-HCI рН 8.5:

121.1 г Три, змішати з 1л де-іонізованої води і встановлюють рН 8,5 з 50% HCI.

4.3.1.3 МТТ розчин:

1.0 г МТТ змішати з 100 мл де-іонізованої води.

4.3.1.4 NBT розчин:

1.0 г NBT змішати з100 мл де-іонізованої води.

4.3.1.5 PMS розчин:

200 мг PMS змішати з100 мл де-іонізованої води.

4.3.1.6 MgCI? розчин:

10 г гексагідрату хлориду магнію змішати з100 мл де-іонізованої води.

4.3.1.7 Сіль яблучної кислоти:

2.5 г DL - яблучної кислоти

змішати з50 мл де-іонізованої води і встановити рН 8,0 з 1М NaOH.

4.3.2 Фарбуючі розчини

4.3.2.1 МЕ фарбуючи розчини:

100 мл 0,1М три-HCI, рН 7.5 (4.3.1.1 розведений 1:10);

400 мл солі яблучної кислоти (4.3.1.7);

1 мл NBT розчину (4.3.1.4);

1 мл PMS розчину (4.3.1.5);

1,8 мл MgCI2 розчину (4.3.1.6);

17.5мг NADP.

4.3.2.2 PGD + PGI фарбуючий розчин:

100 мл 0.1 М три-HCI, рН 7.5 (4.3.1.1 розведений 1:10);

100 мг D - фруктози 6- фосфат Na2 сіль;

60 мг 6-Фосфоглюконової кислоти Na3 сіль;

10 мг NADP;

1 мг МТТ розчину (4. 3.1.3);

1.5 мл PMS розчину (4.3.1.5);

1мл MgCI2 розчину (4.3.1.6);

40 одиниць глюкоза-6-фосфат дегідрогеназа (SIGMA G 5885).

До PGI, не включати глюкоза-6-фосфат дегідрогеназну кислоту.

До PGD, не включати фруктоза-6-фосфат дегідрогеназну або глюкоза-6-фосфат дегідроге­нази.

4.3.2.3 Sh DH фарбуючий розчин:

100 мл 0.2 М три-HCI, рН 8,5 (4.3.1.2 розведений 1:5);

50 мг shikimic кислоти;

1 мл МТТ розчину (2.3.1.3);

1.25 мл PMS розчину (4.3.1.5);

12 мг NADP.

4.3.2.4 PGM фарбуючий розчин:

100 мл 0,1 М три HCI, pH 8.5 (4.3.1.2розведений 1:10);

150 мг a - D - Глюкоза 1-фосфат 1Н2О, Na2 сіль;

150 мг EDTA, Na2;

10 мг NADP;

1.5 мл МТТ розчину (4.3.1.3);

1.0 мл PMS розчину (4.3.1.5);

4 мл MgCI2 розчину (4.3.1.6);

40 одиниць глюкоза-6-фосфат дегідрогенази.

5. Процедура

5.1 Екстрагування ензимів

Паростки отримують за проростання на змоченому папері у темноті за т-ри 25°С протягом 2-3 діб. Лушпиння видаляють, а сім’ядолі подрібнюють при 4°С за допомогою товкачика і беруть 1,5 мл, поміщають у буфер для екстрагування (300 мл) (4.1). Екстракт можна зберігати за температури -30...-80°С.

5.2 Приготування гелю

Гель готують за день до екстрагування.

Готують два 12.5% крохмальних гелів (18*18*1см) у наступному порядку: 128 г крохмалю перемішують в 1020 мл буферного гелю (4.2.1.3 або 4.2.2.2) у 1000 мл і нагріва­ють до 78°С у колбі Бюхнера. Суміш дегазують струменем води протягом 30 секунд. Гель наливають у форму, як описано у керівництві з використання обладнання. Потрібно уника­ти утворення бульбашок. Гель охолоджують до кімнатної температури протягом 45 хви­лин, потім поміщають у холодильник на 1 годину. Г ель загортають у поліетиленовий пакет і зберігають за 4°С протягом 1 години перед використанням.

5.3 Електрофорез

5.3.1 Кожну електродну секцію заповнюють до відповідного об’єму текучим буфе­ром (4.2.1.2 або 4.2.2.1), попередньо охолодженим до 4°С. Поліетиленову плівку підніма­ють і роблять два поперечних розрізи у гелі 3 см і 4 см з краю форми (з боку катода). Шар гелю в 1 см знімають і проводять екстрагування таким чином:

екстракт (5.1) розморожують і абсорбують стрічкою фільтрувального паперу (1,5 мм*20 мм, ватман № 3). Стрічки вставляють у гель щільно до першого розрізу. Одну стрічку за­мочують у бромфенолі синьому (4.2.2.3) (фарбуючий маркер) з кожного боку гелю. Шар гелю обережно повертають. Кожний гель обгортають поліетиленом. Два шари гелю з екст­рактами з боку катода розташовують на двох електродах буферної секції і поміщають в холодильну камеру при 4°С. Електрофорез проводять за 4°С у напрямку аноду. Через 15 хвилин екстракції подають першу напругу, видаляють стрічки і збільшують напругу. Пос­тійну напругу підтримують під час кожної фази.

SGE з рН 5.7 має бути використаний для виявлення ME, PGD і PGI. Ізоензими PGM і ShDH слід виявляти за допомогою SGE з рН 6.5.

5.4 Фарбування ензимів

Після вимикання струму гель розрізають по горизонталі на платівки завтовшки 1 мм стальним дротом або ліскою. Верхня платівка видаляється. Окремі платівки гелю став­лять у термостат за 37°С, у темряві в таких розчинах:

для ME: розчин 4.3.2.1 час перебування в термостаті 15 годин

для PGD і PDI: розчин 4.3.2.2 час перебування в термостаті 1 година

для SHDH: розчин 4.3.2.3 час перебування в термостаті 1 година

для PGM: розчин 4.3.2.4 час перебування в термостаті 1/2 години

Після цього платівки гелю споліскують у де-іонізованій воді і фіксують у 40% роз­чині етанолу. Для тривалого зберігання і успішного використання виконують процедури: висушений гель поміщають між двома поліетиленовими плівками, зволоженими у 5%- ному розчині гліцерину, або зберігають у герметичному поліетиленовому пакеті.

9. Література

Документ UPOV TG/81/6, 2000.