Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Двойной электронно-ядерный резонанс (ДЭЯ Р)

До сих пор мы лишь бегло упоминали о методе ядерного маг­нитного резонанса (ЯМР), но уже отмечали, что метод ЯМР по существу очень похож на ЭПР. Различие состоит лишь в том, что метод ЯМР основан на ориентации ядерных (а не электронных) магнитных моментов в постоянном магнитном поле и изменении этой ориентации в результате поглощения падающего на образен электромагнитного излучения. Таким образом, условие резонанса в этом случае можно записать в виде

Hv = Gl$NH, (3.13)

Где Рдг — ядерный магнетон, a GN — ядерный g-фактор, равный для протона 5,58. Подставив в это уравнение числовые значения, получим, что в магнитном поле напряженностью 10 ООО Э резонанс­ная частота для протонов равна 42,6 МГц. Отсюда следует, что в методе ЯМР доляшы использоваться катушки и конденсаторы, а не микроволновые резонаторы. Это позволяет сконцентрировать магнитное ВЧ-поле, обеспечивающее связь с ядерными магнит­ными моментами, в катушке индуктивности. Основная техниче­ская проблема здесь, как правило, состоит в том, чтобы наиболее эффективно связать эту катушку с исследуемым образцом.

Исторически явление ЯМР было открыто несколькими годами раньше ЭПР, и довольно долго оба эффекта исследовались неза­висимо друг от друга. Но затем, естественно, встал вопрос: что может дать одновременное применение обоих методов при иссле­довании одного и того же образца? Существует несколько способов проведения такого эксперимента. Один из них, разработанный Оверхаузером [14], дает возможность достигнуть в исследованиях ЯМР высокой чувствительности, свойственной ЭПР-спектроско­пии. Другой способ был предложен несколькими годами позже Фехером [15], который показал, что в экспериментах с двойным резонансом можно получить на спектрах ЭПР высокое разреше­ние, свойственное спектрам ЯМР.

В методе двойного электронно-ядерного резонанса в качестве источника энергии для насыщения исследуемого резонансного электронного перехода используется микроволновое излучение высокой мощности. В течение эксперимента внешнее магнитное поле и микроволновая частота сохраняют постоянные значения, соответствующие резонансным условиям, и в то же время на обра­зец подается радиоизлучение, частота которого соответствует ЯМР-переходам. Значение этой частоты непрерывно изменяется, и регистрируется характер ее действия на насыщенную линию

ЭПР. Принцип метода лучше всего проиллюстрировать с помощью фиг. 47, где показан простейший случай — сверхтонкое расще­пление при взаимодействии спина электрона со спином йдра, равным V2 (протон).

Можно видеть, что каждый из начальных синглетных электрон­ных резонансных уровней в результате взаимодействия со спином протона расщепляется на два (энергия этого сверхтонкого рас­щепления равна 1/4 А, где А — константа сверхтонкого расщепле­ния). Но помимо такого обычного сверхтонкого взаимодействия между магнитными моментами неспаренного электрона и протонов имеет место и прямое действие внешнего магнитного поля Н на маг­нитный момент ядра. Это действие, как правило, много слабее сверхтонкого взаимодействия в обычном спектре ЭПР, но тем не менее оно приводит к небольшому сдвигу четырех подуров­ней А — D (фиг. 47). В магнитном поле этим подуровням соот­
ветствуют следующие значения энергии:

Давни Энергия

A —

В ^H-^A + Ig^H

С —H + ±A+±gNQNH

Таким образом, разница в энергии между уровнями А и В и между уровнями С и D неодинакова.

В методе ДЭЯР используется мощное микроволновое излучение резонансной частоты, под действием которого происходит насыще­ние одного из электронных резонансных переходов, например между А и D на фиг. 48, А. В результате насыщения заселен­ность энергетического уровня А увеличивается, и он становится более заселенным, чем уровень В. Если одновременно к образцу подать радиочастоту, подобрав ее таким образом, чтобы Hvv.XI. Было равно величине расщепления между уровнями А и В, то это стимулирует переходы с уровня А на уровень В и заселенности двух этих уровней возвратятся к своим нормальным равновесным значениям. Тем самым насыщение электронного перехода будет снято, и вместо ослабления, вызванного условиями насыщения, внезапно появится интенсивная линия ЭПР. Если система детек­тирования настроена на сигнал ЭПР, то при выполнении условия

Hvv.4=±A-gNf,NH (3.14)

Этот сигнал резко увеличится.

Аналогичная ситуация возникает при прохождении радио­частоты через резонансное значение, соответствующее ядерному переходу между уровнями С и D. Насыщение ЭПР уменьшает заселенность уровня D, но в результате ядерного резонансного перехода, индуцированного радиочастотным полем, заселенность уровней С и D более или менее выравнивается, что снимает насы­щение наблюдаемого сигнала ЭПР; вследствие этого его интен­сивность резко увеличивается. Отсюда следует, что если частоту радиочастотного сигнала медленно менять по обе стороны от Vp.4. = A/2h, то при двух значениях vp.4., удовлетворяющих условию

Hvр. ч. = J Л + gNJ, Nn, (3.15)

Будет наблюдаться резкое увеличение сигнала ЭПР. По этим двум значениям высокочастотного резонансного сигнала можно очень точно определить А и GN.

Обычный сигнал ЭПР для такой системы приведен на фиг. 48,//, а спектр ДЭЯР — на фиг. 48, III. В последнем случае по верти­кальной оси отложено поглощение, обусловленное электронными резонансными переходами; микроволновая частота и напряжен­ность внешнего магнитного поля в течение всего эксперимента сохраняют постоянные значения, соответствующие резонансным условиям. По горизонтальной оси отложена изменяющаяся частота внешнего радиочастотного поля; линии поглощения наблюдаются при тех значениях частоты, кото2)ые соответствуют величине сверхтонкого расщепления между энергетическими уровнями.

Если такой же анализ провести применительно к системе, содержащей не один, а четыре эквивалентных протона, то он покажет, что должны наблюдаться только две линии ДЭЯР, тогда как, согласно фиг. 13, Б, теоретически следует ожидать появления пяти раздельных линий ЭПР. Чтобы объяснить это явление, на фиг. 49, I воспроизведены две группы из пяти равно­отстоящих подуровней каждая, предусматриваемых фиг. 13 для четырех взаимодействующих протонов; но, кроме того, здесь отражено дополнительное действие внешнего поля на ядро, не учитываемое на фиг. 13. Из схемы ясно видно, что в то время как между этими двумя группами уровней могут иметь место пять ЭПР-переходов (при пяти различных частотах), возмоядаы лишь два ДЭЯР-перехода при двух частотах, соответствующих разнице в энергии между компонентами верхней группы и между компонентами нижней группы. Результирующие спектры ЭПР и ДЭЯР, ожидаемые в этом случае, показаны на фиг. 49, II и III. Ясно видно, что спектр ДЭЯР гораздо проще и к тому Hte обеспе­чивает более прямое измерение двух исследуемых параметров. Разница между этими двумя типами спектров становится еще более отчетливой в случае нескольких неэквивалентных протонов. Так наличие одного протона, отличного от других, и взаимодей­ствие с ним остальных протонов приводят к тому, что сверхтонкие линии претерпевают дополнительное расщепление. Таким образом, наличие неэквивалентных протонов увеличивает сложность спектра ЭПР в несколько раз, тогда как в спектре ДЭЯР каждая новая разновидность неэквивалентных ядер приводит к появле­нию лишь двух дополнительных линий. Из всего сказанного ста­новится ясно, что с и стеля,! с большим числом взаимодействующих ядер (особенно неэквивалентных) дают, как правило, очень слож­ную картину сверхтонкого расщепления, которую трудно рас­шифровать, используя обычные методы ЭПР. В то же время спектр ДЭЯР сохраняет в этих случаях относительно простую форму, так как каждый неэквивалентный протон приводит к появлению лишь двух новых линий.

I — насыщение ЭПР-ноглощенин и снятие насыщения резонансом на радиочастоте;

II — теоретически ожидаемый спектр ЭПР (при постоянной микроволновой частоте);

III — наблюдаемый спектр ДЭЯР (при постоянной микроволновой частоте и постояш'ом

Магнитном поле).

Ш

Фиг. 49. ДЭЯР для случая взаимодействия электрона с четырьмя эквива­лентными протонами.

I — общая картина энергетических уровней; II — теоретически ожидаемый спектр - ЭПР (при постоянной микроволновой частоте); III — наблюдаемый спектр ДЭЯР (при постоянной микроволновой частоте и постоянном магнитном поле).

Примеры использования метода ДЭЯР для анализа различных ■сверхтонких взаимодействий в более сложных биологических .молекулах приводятся в гл. 7. Фиг. 118 и 119, где представлены

Спектры трифенилметила и его производных, показывают, что спектры ЭПР очень слояшы, тогда как спектры ДЭЯР сравнительно просты и позволяют легко сделать выводы о сверхтонких взаимодей­ствиях в исследуемой молекуле. Первоначально метод ДЭЯР при­меняли для исследования нераз­решенной сверхтонкой структуры в спектрах органических кристал­лов, и оказалось, что он позволяет осуществить разрешение сверх­тонких компонент, которые не удавалось разрешить в спектрах ЭПР из-за большой ширины линий ЭПР. В последнее время метод ДЭЯР все чаще применяют для исследования свободных радикалов в растворах, и, по-видимому, он вскоре станет мощным орудием расшифровки сложных спектров, получаемых на биологических образцах (более подробно этот вопрос рассмотрен в следующих главах).