ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХЕМИ0СМ0ТИЧЕСК0Г0 СОПРЯЖЕНИЯ

Подробное описание экспериментальных исследований хе- миосмотического сопряжения дано в монографии Скулачева [46]. Здесь мы приводим лишь краткое изложение основных резуль­татов.

Прежде всего необходимо было проверить основное положе­ние теории Митчелла, согласно которому дыхательная цепь ге­нерирует трансмембранный потенциал ионов Н+. Прямые микро­электродные измерения не подтвердили предполагаемое в теории Митчелла высокое сопротивление мембраны (107—108 Ом-см2) и дали значение мембранного потенциала 10—15 мВ со знаком, противоположным предполагавшемуся [49]. Однако эти резуль­таты нельзя считать вполне достоверными (см. [46]). Более па­дежную информацию дает исследование транспорта специфиче­ских ионов через мембрану, вызываемого трансмембранным по­тенциалом.

Валиномицин вызывает поглощение ионов К+ энергизован - ными митохондриями, т. е. митохондриями, способными к реа­лизации сопряжения окисления и фосфорилирования [50]. При нарушении сопряжения митохондрии теряют накопленные ионы К+. Эти результаты согласуются с представлениями Митчелла, по не доказывают их однозначно [46]. Для обнаружения элек­трического поля, направленного поперек мембраны энергизован - ных митохондрий, было необходимо найти ионы, способные про­никать через эти мембраны, перенос которых мог бы осуществ­ляться ферментами — транслоказами без участия электрического поля. Либерман и его сотрудники изучили транспорт ряда спе­циально синтезированных ионов (синтетические ионы) через ис­кусственные фосфолипидные мембраны (см. стр. 140) [51, 52].

Наиболее подходящими оказались ионы с зарядом, экраниро­ванным гидрофобными заместителями (рис. 6.15). В присутствии этих ионов существенно повышается электропроводность си­стемы, так как они быстро диффундируют сквозь мембраны. Да­лее исследовался транспорт этих ионов через митохондриальные мембраны и субмитохондриальные частицы (СМЧ), полученные

ДДА Т ФМФ ТБА

Рис. 6.15. Синтетические анионы и катионы.

ТБ — тетрафеннлбораг, ФКБ — фенилдикарбоундекабораи, ТНФ —тршшгрофенол (ггакрат), ДДА — дибензилдиметил аммоний, ТФМФ— трифенилметилфосфоний, ТБА — тетрабугил-

Аммоний.

Путем обработки митохондрий ультразвуком. Мембраны мито­хондрий и СМЧ оказываются ориентированными противополож­ным образом. Наружная поверхность мембраны СМЧ покрыта структурными элементами, состоящими из шляпки, ножки и под­ставки (см. стр. 290), наружная поверхность мембраны мито­хондрии этих элементов не содержит. Цитохром с локализован на внешней стороне мембраны митохондрий и на внутренней стороне мембраны СМЧ. СМЧ «вывернуты» по сравнению с ми­тохондриями. Можно думать, что внутримитохондриальное про­странство заряжено отрицательно, а внутреннее пространство СМЧ имеет положительный заряд. Оказалось, что энергизация СМЧ добавкой АТФ вызывает поглощение анионов ФКБ (см.

Рис. 6.15), а деэнергизация ингибитором дыхания (антимици- ном) или разобщителем окислительного фосфорилирования ОКФ (гс-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон) вызывает вы­ход анионов. В опытах с митохондриями наблюдается иная кар­тина [46, 53—56]. Удалось показать, что транспорт электронов в мембранах СМЧ сопровождается поглощением анионов ФКБ [55, 57]. Транспорт ФКБ нарушается ингибиторами электронного транспорта, а также разобщителями окислительного фосфори­лирования.

Аналогичные результаты получены и с другими синтетиче­скими анионами [55, 58, 59].

В целом указанные опыты с синтетическими ионами, а так­же ряд других, доказывают, что в сопрягающих мембранах реа­лизуется энергозависимый транспорт ионов, причем анионы и катионы движутся в противоположных направлениях. Механизм транспорта не зависит от структуры ионов, существенна лишь их способность проникать через фосфолипидные мембраны. Из­менение ориентации мембраны относительно окружающей среды приводит к переориентации ионных потоков, направленных про­тив градиентов концентрации ионов [46].

Эти электрофоретические свойства мембран нельзя объяс­нить высказанными ранее представлениями об ответственности специфического фермента—энергозависимой транслоказы — за транспорт ионов (см., например, [60]). Напротив, эти свойства согласуются с теорией Митчелла, исходящей из того, что хими­ческая энергия реакции окисления и фосфорилирования может превращаться в электрическую энергию мембранного потен­циала.

Согласно теории Митчелла (см. § 6.4), перенос протонов и электронов сквозь мембрану не приводит к большим изменениям рН. Транспорт электронов, т. е. окислительный процесс, прекра­щается под действием электрического поля, создаваемого избыт­ком отрицательных зарядов на другой стороне мембраны. Пере­нос электронов активируется вновь при уменьшении поля, т. е. при уменьшении мембранного потенциала. Этого можно достичь перемещением катионов через мембрану. В результате должен возникнуть градиент рН, так как перенос каждого одновалент­ного катиона должен сопровождаться освобождением одного протона во внешней среде. В работах [3, 53—55] действительно показано, что добавление проникающих синтетических катионов ДДА, ТФМФ, ТБА (см. рис. 6.15) к митохондриям вызывает уве­личение концентрации Н+ в среде. Изменения рН исчезают при добавке разобщителей. Сам Митчелл показал, что при работе дыхательной цепи среда подкисляется [42, 43].

Таким образом, установлено, что энергизация сопрягающей мембраны создает трансмембранный потенциал Дф и ДрН.

Из теории Митчелла следует, что энергия дыхания, транс­формированная из химической формы в электрическую и осмо­тическую, может вновь перейти в химическую форму при син­тезе АТФ или обратном переносе электронов. Митчелл посту­лирует, тем самым, обратимость биоэнергетического процесса. Это положение также подтверждено (см. [44]). Реализуется так называемое ионное фосфорилирование — синтез АТФ из АДФ п Фн за счет электрической или осмотической энергии, выде­ляемой при движении ионов через мембрану по концентрацион­ному градиенту.

Хорошими тестами на траисмембранный потенциал являют­ся изменения спектров поглощения цитохромов, вызываемые их окислением и восстановлением [61, 62]. При исследованиях по­ведения цитохромов в СМЧ может оказаться весьма полезным магнитооптическое вращение, аномальная дисперсия которого очень чувствительна к изменению состояния группы гема, со­держащейся в цитохромах (см. [2], гл. 7). Удается наблюдать такую аномальную дисперсию для цитохрома с во взвеси СМЧ.

Рис. 6.16. Транспорт протонов разобщите­лем ДНФ.

Снижение Аф должно приводить к нарушению сопряжения окисления и фосфорилирования. К этому сводится действие раз­общителей сопряжения. Таковыми являются динитрофенол

ДНФ, ФКФ и ряд дру­гих веществ. ДНФ, по - видимому, действует как переносчик протонов, со-

Н+ гласно схеме Митчелла, показанной на рис. 6.16. Очевидно, что если эта схема верна, то любые слабые кислоты и осно­вания должны оказывать разобщающее действие.

Установлено, что разобщители действительно повышают протонную проводимость мембран митохондрий [63]. Сход­ные результаты были получены и на искусственных фосфо - липидных мембранах [53, 64—66]. Выявлено далеко идущее сходство этих мембран с внутренними мембранами мито­хондрий. Найден новый класс сильных разобщителей — произ­водных барена [52] (дальнейшие подробности см. в [46]).

По схеме Митчелла [42, 43] протоны и электроны шесть раз пересекают мембрану на пути от НАД-Н к 02. Стадии переноса Н+ и е~ чередуются. Для детального рассмотрения и аргумен­тации этой схемы нужно иметь представление о локализации компонентов реакции. Установлено, что цитохром с локализо­ван у внешней стороны мембраны митохондрий, а ферменты трансгидрогеназа, НАД-Н-дегидрогеназа и сукцинатдегидроге-
наза—у внутренней ее стороны. В «вывернутых» СМЧ лока­лизация обратная.

В работах лабораторий Либермана и Скулачева расположе­ние дыхательной цепи определялось по ее способности образо­вывать мембранный потенциал, регистрируемый с помощью

Мембрана

ГГ — трансдегидрогеназа, а, ая, с, с i, b — цитохромы, ФМН — флазппмопопуклеотид, Fe — комплексы негеминового железа, катализирующие перенос электрона, Си — медьсодер­жащий белок.

ФКБ [55, 57, 59]. В среду вводились различные доноры и ак­цепторы электронов, не проникающие через мембрану. Оказа­лось, что эти вещества взаимодействуют лишь с цитохромом с в митохондриях. Компоненты, взаимодействующие с трансгид- рогеназными звеньями цепи, не эффективные в митохондриях, поддерживают транспорт ФКБ в СМЧ. Проникающие доноры и акцепторы эффективны в обоих случаях. Эти опыты показы­вают, что происходит транспорт протонов и (или) электронов по дыхательной цепи. В других экспериментах как прямых, так и косвенных, установлена локализация ряда компонентов в мембране митохондрий Г461. На рис. 6.17 показано вероятное расположение дыхательной цепи [46]. Схема эта в целом пока во многом гипотетична, но отдельные ее элементы можно счи­тать установленными.

Методы тестирования мембранной разности потенциалов посредством синтетических ионов были с успехом применены также к изучению возникновения Аф в ходе трансгидрогеназ - ной реакции переноса водорода между двумя нуклеотидами. Эта реакция

НАДФ-Н + НАД+ ъ=± НАДФ+ + НАД-Н

Также локализована в митохондриях. Опыт подтверждает пред­ставление Митчелла о том, что в указанной реакции происхо­дит обратный перенос электронов, идущий с затратой энергии (см. [46]).

Согласно хемиосмотической гипотезе любая сопрягающая система должна создавать разность электрохимических потен­циалов ионов Н+. Действительно, опыты с проникающими син­тетическими ионами показали возникновение Аф в митохонд­риях, СМЧ, хлоропластах (см. гл. 7), мембранах бактерий не­зависимо от степени сложности системы сопряжения и от ис­пользуемого источника энергии [46].

Таким образом, ряд основных положений теории Митчелла подтвержден экспериментально. Однако, как указывает Ску - лачев [46], это еще нельзя считать однозначным доказательст­вом справедливости теории. Теория постулирует существование пяти различных механизмов генерации Аф: АТФ-азу и четыре механизма энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Нужно еще доказать, что альтернативные теории возникнове­ния мембранного потенциала, в отличие от теории Митчелла, не согласуются с фактами. Соответствующий анализ проведен в монографии Скулачева, приходящего к выводу о непригодности других моделей и справедливости хемиосмотической теории [46]. В частности, отпадают, по-видимому, представления о том, что митохондрии содержат помимо АТФ еще какой-то нефос - форилированный высокоэнергетический предшественник АТФ (см. [67]). Основная форма энергии в клетке есть электриче­ская энергия, определяемая трансмембранным потенциалом протонов. Именно электрическая энергия ответственна за со­вершение различных типов химической и осмотической работы, а также за теплопродукцию митохондрий. Существенно то об­стоятельство, что энергия, вырабатываемая в каком-либо участ­ке митохондрии, доступна митохондрии в целом и может быть использована для совершения любого вида работы в любом другом участке. Общая схема путей превращения энергии в сопрягающих мембранах показана на рис. 6.18 [46].

Детальные исследования суспензий изолированных мито­хондрий (из сердца голубя) показали, что окислительно-восста­новительные реакции, сопряженные с фосфорилированием, про­текают в условиях, близких к равновесию [68]. Дыхательная цепь митохондрий состоит из трех изопотенциальных групп: НАД+/НАД-Н с потенциалом около —0,34 В (если окисляемый субстрат — сукцинат), цитохром Ь и кофермент Q с ф ^ 0, ци­тохромы с и а и другие звенья с ф ж 0,275 В. Перенос восста­навливающих эквивалентов между двумя соседними группами

Тепло Тепло

Рис. 6.18. Пути превращения энергии, освобождающейся при переносе элек­тронов в сопрягающих мембранах [46].

Сопряжен с синтезом АТФ. Изменение свободной энергии та­кого переноса от НАД-Н к цитохрому с равно расходу свобод­ной энергии на синтез двух молей АТФ. Измеренные значения констант равновесия были близки к теоретическим. В ряде ра­бот было показано, что на путях метаболизма имеется мно­жество ферментативных стадий, близких к равновесию [69—71]. Как указывается в работе [68], суммарный метаболический про­цесс далек от равновесия вследствие наличия нескольких реак­ций, сильно смещенных от равновесия. Именно эти реакции осуществляют кинетический контроль над общим потоком ме­таболитов. Равновесные реакции образуют основную систему, на которую наложены необратимые процессы.

Несмотря на описанные факты, было бы преждевременным считать теорию Митчелла доказанной и полностью - аргументи­рованной (см. [111]).

Согласно исходным представлениям Митчелла, запасание энергии в АТФ происходит за счет накопления разноименных зарядов на стенках мембраны, создания мембранного потен­циала и разности концентраций протонов. Это означает, что синтез АТФ может быть не эндергоническим, т. е. может проте­кать самопроизвольно — первичным макроэргом является сама мембрана. Однако, как указано выше (см. стр. 286), величина свободной энергии фосфорилирования не равна нулю — необхо­дим специальный механизм сопряжения, покрывающий дефи­цит свободной энергии. Соответственно, Митчелл далее вводит представление о синтезе в мембране предшественника АТФ — неизвестного пока вещества X с меньшим энергосодержанием (около 4,5 ккал/моль). Энергия нескольких молекул X пере­дается одной молекуле АДФ при ее фосфорилировании. Это положение теории остается недоказанным. В целом пока нет полного ответа на основной вопрос — достаточна ли энергия протонов для фосфорилирования АДФ. Предположение об одно­временном участии в синтезе АТФ других ионов в принципе мо­жет улучшить ситуацию, но проверка его связана с большими трудностями. Теория Митчелла в целом согласуется с пред­ставлением о квазиравновесии в сопряженных митохондриаль- ных процессах. Однако из всего изложенного следует, что эта теория является феноменологической и не рассматривает моле­кулярные механизмы окислительного фосфорилирования. Она не учитывает, несомненно, наличествующих в системе электрон - но-конформационных взаимодействий (ЭКВ), ответственных в конечном счете за все ферментативные процессы в митохонд­риях. Мы еще мало знаем о сущности ЭКВ в цитохромах и других ферментах, участвующих в окислительном фосфорили­ровании. Между тем, именно при исследовании этого процесса концепция ЭКВ (см. [3], гл. 6) должна быть особенно эффек­тивной, так как митохондриальная система реализует транспорт электронов.