ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

СТРУКТУРА МЕМБРАН

Феноменологическое рассмотрение мембранного транспорта на основе неравновесной термодинамики или кинетических мо­делей не дает сведений о молекулярных механизмах явления. Развитие физики мембран связано с детальным изучением их молекулярного строения и молекулярной функциональности. Биологическая мембрана есть динамическая организованная си­стема; необходимо исследовать как ее устройство, так и дина­мику ее поведения. Соответствующие задачи очень сложны и, несмотря на громадное число работ, им посвященных, мы не располагаем еще сколько-нибудь полной картиной динамической мембраны. Тем не менее сейчас установлен ряд важных фактов и предложены убедительные модели мембран.

Мембраны состоят в основном из липидов и белков. В клет­ках млекопитающих содержатся и небольшие количества угле­водов, связанных с белками (гликопротеиды) или с липидами (гликолипиды). Во внутренних мембранах присутствуют в ос­новном фосфолипиды, в плазматических содержатся и нейтраль­ные липиды. Так, в мембранах эритроцитов 30% липидов обра­зует холестерин.

В табл. 3.4 [64] приведено относительное содержание белков и липидов, в также холестерина и фосфолипидов в различных биологических мембранах.

Таблица 3.4

Состав биологических мембран

Холестерии/фосфо- липид (молярное отношение)

Велок/липид (весовое отношение)

Мембрана

0,25

0,7-1,2 0,3-0,5

1,0-1,4 2,2 1.5-4,0

0,9-1,0

0,7-1,2 1,2 3,6 1,5

0,03-0,08 0,03-0,09 0,02-0,04 0,13 0

0,8

Миелииовая оболочка Плазматические мембраны

Клетки печени

Клетки асцита Эрлиха

Тени эритроцитов Внутренняя мембрана

Эндоплазматический ретикулум Внешняя мембрана митохондрий Внутренняя мембрана митохондрий Палочки сетчатки Ламеллы хлоропласта

Для изучения состава мембран необходимы методы выделе­ния из мембран индивидуальных компонентов. Сейчас такие ме­тоды хорошо разработаны. Они основаны на применении детер­гентов (например, додецилсульфата натрия), солюбилизирую - щих нерастворимые вещества, и разделении полученных белков путем электрофореза в полиакриламидном геле [64, 65].

В большинстве случаев мембраны чрезвычайно гетерогенны. Фосфолипиды и липиды представлены в них целыми семейства­ми. Так, в мембранах эритроцитов человека содержится не ме­нее 20 видов лецитина [66]. На рис. 3.7 представлена схема, показывающая строение и состав липидов в этих мембранах [67]. Липиды построены из полярной «головы» и двух длинных непо­лярных углеводородных «хвостов», обладающих гидрофобными свойствами. Как мы увидим, этим определяется структура мембран.

Белки мембран также разнообразны. Около трети белков мембраны эритроцита образует спектрин, состоящий из двух компонентов с молекулярными весами 255 000 и 220 000. Вторая треть — ряд белков с молекулярными весами около 90 000 и тре­тья треть — белки с молекулярными весами 9000— 15 000 [65, 68]. Существуют мембраны и более простого состава — внутрен­ние мембраны палочек сетчатки содержат лишь один белок — родопсин (см. гл. 7). Состав мембран каждого типа клеток спе­цифичен, что, по-видимому, имеет прямое функциональное зна­чение. Было высказано предположение о присутствии на внеш­ней стороне цитоплазматической мембраны характеристических белков, ответственных за узнавание [69].

Липиды играют не только структурную роль в мембранах. Можно было бы представить себе и чисто белковую мембрану, молекулы которой связаны друг с другом слабыми взаимодей­ствиями, прежде всего гидрофобными. Таких мембран, однако, нет, хотя известны стабильные белковые надмолекулярные структуры (например, коллаген) и белково-углеводные мембра - ноподобные системы. Можно думать, что белковая мембрана была бы слишком стабильна и, тем самым, лишена структурной лабильности, необходимой для многообразной функциональности мембраны [70].

Основываясь на косвенных данных о свойствах клеток и про­ницаемости мембран, Даниэлли и Давсон еще в 1935 г. предло­жили модель универсальной биологической мембраны, так на­зываемой унитарной мембраны [71]. Эта модель симметрична. Матрикс мембраны, ее внутренность формируют неполярные «хвосты» липидов, образующие два слоя. На поверхность вы­ходят полярные «головы» липидов, взаимодействующие с внеш­ними мономолекулярными белковыми слоями. В дальнейшем эту модель неоднократно модифицировали и усовершенствовали

Рис. 3.7. Структура и состав липидов и фосфолипидов в мембране эритроцита человека.

На основании данных, полученных с помощью электронной мик­роскопии и рентгенографии. Модель Робертсона [72] состоит из двух липидных слоев с гидрофобными «хвостами», обращенными внутрь, и полярными «головами», смотрящими наружу. Моно­молекулярные слои белка различны на двух сторонах мембраны. Толщина внутреннего гидрофобного билипидного слоя около 35 А, толщина каждого из внешних слоев, состоящих из поляр­ных «голов» и белка, — около 20 А, толщина унитарной мембра­ны в целом — около 75 А. Другие модели приведены в [2].

Данные, полученные методом электронной микроскопии, воз­можно, требуют уточнений. Оттенение препаратов производится 0s04, KMn04 и т. п. Химия происходящих при этом процессов еще недостаточно изучена, неясно также, что происходит при выделении мембран и подготовке препаратов. Здесь не исклю­чены артефакты. Тем не менее основной принцип построения унитарной мембраны — двуслойное расположение липидов — по-видимому, правилен. Это доказывается, в частности, рентге­нографическими данными. Установлено, что чистые фосфоли- пиды, диспергированные в воде и образующие бимолекулярные слои вследствие гидрофобных взаимодействий, дают дифрак­ционную картину, весьма сходную с картинами, получаемыми с диспергированными биологическими мембранами. Оказалось, что столь различные объекты, как мембраны эритроцитов, бак­терий Mycoplasma laidlawii и плазматические мембраны нерв­ных окончаний крысы, имеют в основном сходное строение, со­гласующееся с унитарной моделью.

Сказанное, однако, не относится к расположению белков в мембране. Предложенные модели исходят из того, что мембран­ные белки имеют гидрофильные, полярные, поверхности, взаи­модействующие с полярной липидной поверхностью мембраны. В действительности это не так. Были проведены исследования выделенных мембранных белков и мембран косвенными метода­ми— воздействием на них протеолитических ферментов и вклю­чением в белки мембран различных меток [2,5]. Оказалось, что белки мембран можно разделить на два класса. Одни из них связываются только поверхностями мембраны; подобно глобу­лярным белкам, функционирующим в водном окружении, они имеют гидрофильную поверхность. Белки второго класса спо­собны проникать в мембрану, взаимодействуя с гидрофобными «хвостами» липидов. Такие белки нерастворимы в воде и имеют преимущественно гидрофобный характер [68]. Исследования мембран методами инфракрасной спектроскопии, спектрополя - риметрии, спектроскопии ЯМР и т. д. указывают на разнообра­зие белковых структур и, вероятно, значительную роль взаимо­действия белков друг с другом, не учитываемого в унитарной модели [73]. В модели Бенсона [74] глобулярные белки «утоп­лены» в мембране. Липиды не образуют сплошного бимолеку­лярного слоя, но рассредоточены между белковыми глобулами так, что их углеводородные «хвосты» контактируют с гидрофоб­ными участками белков (см. также [65, 75]).

В настоящее время наиболее правдоподобной представляется мозаичная модель мембраны, отличная и от модели Даниэлли и Давсона, и от модели Бенсона.

Ряд данных непосредственно доказывает, что в отличие от унитарной модели белки в мембране распределены асимметрич­но. Для исследования применялись методы изменения наружной поверхности мембраны под действием непроник'ающих агентов, идентификация наружных компонентов с помощью специфиче­ских антител, введение селективных меток, сравнение фермента­тивной и транспортной активностей нативных и «вывернутых» везикул и т. д. [75]. Особенно детально изучены мембраны эри­троцитов. Прямой метод локализации компонентов мембраны — ЯМР-спектроскопия с применением гидрофильных парамагнит­ных меток — дал особенно убедительные доказательства этой асимметрии [75—78].

Важные результаты получены при помощи методики скалы­вания в замороженном состоянии (freeze etching). Мембраны быстро замораживают при температуре жидкого азота и дробят в вакууме. Лед сублимируется, образец оттеняют, реплицируют платиной и углеродом и исследуют под электронным микроско­пом. Выяснилось, что излом проходит вдоль внутренней гидро­фобной области мембраны эритроцита. При этом обнаружились большие глобулярные частицы диаметром до 75 А. Эти части­цы — белки [65, 79, 80].

Многие свойства биологических мембран, не связанные с фер­ментативной активностью, удается моделировать эксперимен­тально. Оказалось возможным получать и исследовать искус­ственные липидные мембраны, имеющие двухслойное строение.

Стабильные двухслойные системы такого рода были впервые получены в 1962 г. [81]. Искусственные мембраны получаются при контакте смеси фосфолипидов и нейтральных липидов, рас­творенных в органических соединениях, с водой. При этом можно получить «черные» мембраны, т. е. тонкие слои, лишен­ные интерференционных цветов. Толщина таких мембран ме­нее 100 А. Разработаны весьма надежные способы их изготовле­ния (см., например, [82]). Используются как природные, так и синтетические липиды [83].

Искусственные двухслойные липидные мембраны весьма раз­нообразны, но в целом сходны с моделью унитарной мембраны. Внутри расположены неполяриые группы липидов, снаружи — их полярные участки. Искусственные двухслойные мембраны имеют физические свойства, очень близкие к свойствам биоло - гических мембран, как о том свидетельствует табл. 3.5 [84]. Электронно-микроскопические картины также оказываются сходными.

Таблица 3.5

Сравнение свойств двухслойных липидных и биологических мембран

Свойства

Биологическая мембрана при 25 °С

Двухслойная мембрана при 36 °С

Искусственные двухслойные мембраны, естественно, лишены метаболической активности и не обладают столь высокой селек­тивностью, как биологические мембраны. Вместе с тем, они мо­делируют важные свойства биомембран, что позволяет изучать переносчики ионов и возбудимость. Все это показывает, что двухслойная липидная структура в той или иной мере свойствен­на биологическим мембранам.

Обладают ли липиды специальной функциональностью по­мимо их способности образовывать слоистые структуры, гидро­фобные внутри и гидрофильные снаружи? Роль липидов далеко не изучена, но в работах Лузатти с сотрудниками [85—88] уста­новлено, что в системах липид — вода наблюдается ряд различ­ных фаз в зависимости от состава системы и температуры и изучены эти фазы. Они могут быть лишены ближнего порядка или обладать частично упорядоченными парафиновыми цепями. Напротив, наблюдаются фазы с дальним порядком, подобные кристаллам или, скорее, жидким кристаллам (исключением служат мицеллярные изотропные растворы, получаемые при малой концентрации липидов, — мыла). Обнаружены также сложные ламеллярные и стержнеобразные структуры липи­дов — ламеллярные фазы могут представлять собой двумерные слои липидов, чередующиеся со слоями воды и уложенные в од­номерную решетку с вращательным беспорядком. Наблюдаются и плоские липидные слои, упакованные в двумерную гексаго­нальную решетку с вращательным беспорядком, лентообразные структуры с конечными ширинами ламеллярных элементов, ди­ски, организованные в объемно центрированную орторомбиче - скую решетку. Наблюдаются стержнеобразные фазы, образован­ные бесконечными или конечными стержнями — двумерная гек­сагональная совокупность бесконечных стержней, плоские дву­мерные квадратные и гексагональные сетки и сложные трехмерные сетки.

Эти системы представляют самостоятельный научный инте­рес, сочетая высокий дальний порядок с отсутствием ближнего порядка и обладая большой гетерогенностью и углеводородных цепей, и полярных групп. Есть основания думать, что многофаз - ность липидных систем имеет прямое отношение к функциям биологических мембран (см. ниже).