ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА

Явления молекулярного узнавания, реализуемые посред­ством слабых взаимодействий, ответственны за совокупность ре­гуляторних процессов в живой клетке, определяющих весь ход ее развития (см. гл. 9). Молекулярные взаимодействия форми­руют необходимые для регуляторных процессов обратные связи. Это относится, в частности, к функционированию аллостериче - ских ферментов ([1], гл. 7). Здесь мы рассмотрим молекулярную регуляцию биосинтеза белка, регуляцию действия генов.

Синтез белка искажается при воздействии мутагенов на ДНК- Немутагенные вещества также могут существенно влиять на. работу генов. Это ярко выражается в явлении так называе­мого индуцированного синтеза ферментов. Клетки Е. coli дикого типа, растущие в среде из неорганических солей с негалакто - зидным источником углерода (с янтарной кислотой), почти не синтезируют фермент р-галактозидазу, катализирующий гидро­лиз галактозида — лактозы до глюкозы и галактозы. Добавле­ние индуктора, например, метилтиогалактозида к растущей культуре Е. coli дикого типа увеличивает скорость синтеза р-га - лактозидазы в 103 раз. Галактозид служит индуктором синтеза, а дикий тип Е. coli представляет собой индуцируемый тип. Имеются мутантные штаммы Е. coli, синтезирующие р-галакто - зидазу и без действия индуктора. Такие мутанты называются конститутивными. Опыты с мечеными атомами показали, что индуцированный синтез фермента происходит de novo из сво­бодных аминокислот. Индуктор воздействует на генетическую систему клетки. Жакоб и Моно провели генетический анализ индуцированного синтеза, исходя из простой гипотезы, полу­чившей в дальнейшем веские подтверждения [72, 73]. Гипотеза состояла в том, что индуцированный синтез подавляется специ­фическим соединением, находящимся в цитоплазме. Это соеди­нение— репрессор — синтезируется под контролем особого гена - регулятора. В дальнейшем было установлено, что репрессоры представляют собой белки [74, 75].

Репрессор действует на ген-оператор, управляющий перено­сом информации от нескольких структурных генов к синтези­руемым белкам. При воздействии репрессора прекращается ра­бота всей совокупности этих генов.

Индуктор синтеза взаимодействует с белком-репрессором и выключает его влияние на ген-оператор. Возможен и противо­положный процесс активации некоторым метаболитом неактив­ного репрессора. Такой метаболит называется корепрессором.

На рис. 1.9 показана схема описанной генетической системы. Группа структурных генов, контролируемая одним геном-опера­тором, называется опероном. В рассматриваемом примере ре­прессор р-галактозидазы контролирует синтез по крайней мере Двух ферментов: р-галактозидазы и p-галактозидпермеазы. Вто­рой фермент определяет скорость поступления Р-галактози - Дов в бактериальные клетки сквозь мембраны. В отсутствие

Р-галактозидпермеазы клетки Е. соїі не могут накапливать Р-галактозидазу. Синтез двух ферментов необходимым образом коррелирован.

Описанная модель (оперон) полностью подтверждена гене­тическими исследованиями, доказавшими существование гена - регулятора и гена-оператора и установившими свойства соот­ветствующих мутаций (см., например, [76], гл. 7). Синтез Р-галактозидазы в Е. coli контролируется так называемым Лак - опероном. На него действует Лак-репрессор — тетрамерный бе­лок с молекулярным весом 150 000. На основе модели оперона проведено теоретическое рассмотрение химической дифференци- ровки системы, развивающейся в процессе онтогенеза (см. § 9.10).

В настоящее время известны системы, в которых один специ­фический репрессор воздействует на несколько несвязанных оперонов (см. также [77]).

Контроль гена-оператора над опероном, по-видимому, опре­деляется тем, что синтез мРНК начинается с того конца опе­рона, который примыкает к соответствующему оператору.

Описанный способ контроля и регуляции биосинтеза белка у прокариотов еще не может обеспечить регуляторные нужды клетки. Белки, кодируемые одним и тем же опероном, могут требоваться в разных количествах и в разное время. Для пони­мания соответствующих регуляторных явлений необходимо детальное рассмотрение механизма синтеза мРНК на ДНК, про­текающего с непременным участием РНК-полимеразы (см. [78]). Процесс образования начала молекулы РНК существенно отли­чен от последующего роста ее цепи. Соответственно рационально рассматривать начало синтеза РНК (инициацию) и продолже­ние этого синтеза (элонгацию) как две самостоятельные стадии.

ДНК-зависимый синтез РНК подавляется рядом антибиоти­ков, таких, как актиномицин, которые блокируют матрицу ДНК [79]. Антибиотики группы рифамицина, напротив, действуют не на матрицу ДНК, но на РНК-полимеразу [80]. Установлено, что этот фермент содержит специфический центр, в котором связы­вается рифамицин. Центры связывания РНК-полимеразы с мат­рицей и рифамицином формируются различными полипептида­ми [81]. Рифамицин оказывает свое действие на стадии ини­циации, препятствуя образованию первой межнуклеотидной связи. Другие вещества ингибируют элонгацию, влияя на РНК - полимеразу. Напротив, актиномицин препятствует элонгации, взаимодействуя с ДНК, а не с ферментом [78].

Регуляция транскрипции далеко не всегда реализуется по схеме Жакоба и Моно посредством репрессора, негативного ре­гуляторного фактора. В случае фаговых ДНК считывание опре­деленных генов не происходит и в отсутствие каких-либо ре - прессоров. Для включения этих генов необходимы позитивные регуляторные факторы.

При заражении клетки Е. coli Т-четными фагами (Т2 и Т4) реализуется четко отрегулированная временная последователь­ность процессов транскрипции. Через несколько минут после заражения происходит выключение синтеза мРНК и белков клетки-хозяина и синтезируется несколько новых ферментов, не­обходимых для синтеза фаговой ДНК, а затем осуществляется синтез структурных белков фага. Как показал Хесин и его сотрудники, специфические фаговые мРНК появляются при фа­говой инфекции не сразу, а последовательно [82, 83]. На ранних и поздних стадиях развития фага Т2 в клетке Е. coli образуются отличающиеся друг от друга наборы мРНК, синтезируемые на разных группах генов. РНК-полимераза способна узнавать про­моторы генов мРНК, образующиеся на ранних стадиях фаговой инфекции. Аналогичные группы «ранних» и «поздних» РНК обнаруживаются и при развитии фага Т4 [84]. Оказалось, что появление разных групп мРНК фага Т4 зависит от процессов синтеза белка и репликации фаговой ДНК-

Модели, предлагаемые для объяснения этих регуляторных явлений, исходят из рассмотрения сложной субъединичной структуры РНК-полимеразы, которая изменяется при воздей­ствии белковых регуляторных факторов [74]. Детальные молеку­лярные механизмы временной регуляции белкового синтеза пока неизвестны. Так или иначе, эти механизмы должны определять­ся молекулярным узнаванием на уровне фермента и матрицы, на уровне молекул белков и нуклеиновых кислот.

Регуляторные воздействия на биосинтез белка реализуются, по-видимому, на всех его стадиях. Регуляции подлежит работа полимераз, аминоацил — тРНК-синтетазы и рибосом. Воздей­ствия химических соединений на биосинтез далеко не сводятся к мутагенезу. Так, антибиотики влияют на трансляцию кода, воздействуя на рибосомы. Стрептомицин нарушает трансляцию в бесклеточной системе (см. [85]). Этот антибиотик внедряется в 305 субъединицы рибосомы.

Важным регулятором функциональности генов на уровне трансляции является циклическая аденозинмонофосфорная кис­лота цАМФ. Остановимся на свойствах этого вещества (см. [86, 87, 128]), структура которого показана на рис. 1.10. Цикличе­ская - АМФ функционирует как химический сигнал, регулирую­щий ферментативные реакции в клетках, запасающих сахара и жиры. Циклическая АМФ регулирует также транскрипцию ге­нов. Впервые со свойствами цАМФ столкнулись при изучении активности гормона адреналина. Этот гормон повышает уровень сахара (глюкозы) в крови. Глюкоза поступает в кровь из кле - ТРк, запасающих животный крахмал — гликоген. Сложный процесс воздействия адреналина состоит из многих стадий. Адреналин является медиатором лишь первой из них, активируя фермент аденилатциклазу. Под действием этого фермента АТФ трансформируется в цАМФ, активирующую фермент, действую­щий в первом звене последовательности реакций, завершаю­щейся конверсией гликогена в глюкозу. Как показали Сазер - ленд и его сотрудники, цАМФ играет роль «вторичного мессенд-

Жера» — универсального внутриклеточ­ного посредника при действии ряда гормонов — «первичных мессенджеров» [129].

Циклическая АМФ присутствует в разнообразных клетках в количествах примерно в 1000 раз меньших, чем АТФ. Содержание цАМФ в клетке контроли­руется посредством ферментативной ре­гуляции скорости ее синтеза из АТФ и превращения цАМФ в инертную нецик­лическую АМФ.

Эти малые количества цАМФ все же на два-три порядка больше коли - Рис. 1.10. Циклическая чества гормона. Тем самым обеспечи - аденозинмонофосфорная вается более чем 100-кратное усиление кислота (цАМФ). внешнего сигнала, воздействующего на клетку [128].

Воздействие цАМФ на гены состоит в стимуляции их актив­ности в процессе транскрипции. Циклическая АМФ служит хи­мическим триггером, включающим в ряде случаев процесс транскрипции гена. Ее действие состоит в связывании белка-ре­цептора цАМФ. Транскрипция начинается, когда комплекс цАМФ с белком-рецептором активирует некоторый промотор - ный участок ДНК в начале оперона (опыты проводились с Е. coli и активировался оперон лактозы, Лак-оперон). РНК - полимераза присоединяется к активированному промоторному участку и затем перемещается вдоль цепи ДНК, организуя син­тез мРНК. Комплекс цАМФ — рецептор не содействует транс­крипции при наличии специфического белка, Лак-репрессора. Циклическая АМФ может стимулировать транскрипцию ряда различных оперонов. Действие цАМФ в клетках эукариотов иное, но она и здесь влияет на генетическую систему — на мат­ричную активность хроматина (см. [128]).

Роль цАМФ действительно универсальна. Это вещество уча­ствует в процессе зрительного возбуждения и регулирует агре­гацию «общественных амеб». Разнообразие функций цАМФ демонстрируется различием между механизмом деградации гли­когена и липидов, с одной стороны, и стимулированием транс­крипции генов — с другой. Сформулирована гипотеза, согласно которой дифференцировка эмбриональных клеток может опре­деляться содержанием в них цАМФ и цГМФ (а также неорга­нических катионов — щелочных, щелочно-земельных и Zn++) [130].

Редупликация ДНК, происходящая на определенной стадии развития клетки, также представляет собой регуляторный про­цесс. В работах [88, 89] предложена гипотеза, согласно которой репликация ДНК индуцируется некоторым белковым вещест­вом. Генетический элемент (хромосома или эписома) реплици­руется как целое после такой индукции. Подобный элемент име­нуется репликоном.

В отличие от оперона репликон начинает функционировать под действием некоторого инициатора, а не индуктора, связы­вающего репрессор. Инициатор является не негативным, но по­зитивным регуляторным фактором. Циклическая хромосома ДНК бактерии или фага содержит структурный ген, ответствен­ный за синтез активирующего белка, действующего на ген-реп­ликатор. Возможно, что при этом происходит разрыв кольца и хромосома реплицируется как целое. Гипотеза репликона при­водит к ряду генетических выводов о природе мутантов струк­турных генов и репликатора, подтверждаемых эксперименталь­но [90]. Многие факты, включая результаты прямых электронно - микроскопических исследований, показывают, что во время деления бактериальной клетки инициатор связан с клеточной мембраной. Молекулярные процессы лежат в основе клеточных.