ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

БИОСИНТЕЗ БЕЛКА В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТОВ

Генетический аппарат многоклеточных организмов — эука- риотов — иной, чем у бактерий — прокариотов, не имеющих ядер. Хромосомы эукариотов содержат не только ДНК, но и белки — они построены из нуклеопротеидов. Важнейшие белки хромосом — гистоны, представляющие собой основные белки, со­держащие значительные количества лизина и аргинина (см. ниже стр. 45). Кроме того, в хромосомах присутствуют разно­образные негистоновые белки.

Все соматические клетки одного организма содержат один и тот же набор генов, тождественный набору генов в исходной зиготе. В то же время клетки различных тканей сильнейшим образом отличаются друг от друга и морфологически и функ­ционально. Их различия сводятся к тому, что в разных клетках одного и того же организма функционируют различные белки. Это означает, что в разных клетках работают разные гены и молекулярный смысл дифференцировки, приводящей к специа­лизации клеток эукариотов, состоит в регуляции работы генов.

В клетке данного сорта трансляция осуществляется лишь для малой доли генов.

Ряд фактов показывает, что модель оперона Жакоба иМоно, описанная в предыдущем параграфе, неприменима для эукарио - тов. В то же время общие принципы регуляции функциониро­вания ДНК, впервые введенные в этой модели, сохраняют свое значение. Гены эукариотов действуют независимо друг от друга, но их совокупности образуют целостные регуляторные системы, которые можно назвать транскриптонами. Оперон есть бакте­риальный транскриптон.

Вследствие не преодоленных еще трудностей при расчлене­нии ДНК эукариотов на отдельные функциональные отрезки основные результаты, относящиеся к организации транскрип­тона, получены путем исследования РНК, синтезируемой на ДНК. В работах Георгиева и его сотрудников было показано существование в животных клетках нового типа РНК — ядерной РНК, которая является предшественником мРНК [91, 92]. Соот­ветственно эта РНК обозначается как про-мРНК. Про-мРНК имеет очень большой молекулярный вес, она состоит в среднем из 10 000—15 000 нуклеотидов. мРНК, на которой строятся бел­ки, состоит в среднем всего лишь из тысячи нуклеотидов.

Установлено, что про-мРНК превращается в мРНК, но при этом большая часть про-мРНК распадается. Участки про-мРНК, из которых получается мРНК, и распадающиеся участки син­тезируются на разных участках ДНК-

Вся про-мРНК связана со специфическими белковыми части­цами— информоферами. Комплексы про-мРНК с информофера - ми в синтезе белка не участвуют.

Исходя из этих фактов, Георгиев предложим модель транс­криптона эукариотов, состоящего из большой акцепторной зоны и относительно малой структурной зоны, непосредственно ответ­ственной за синтез одного или нескольких белков. Акцепторная зона не несет структурной информации, но содержит участки, взаимодействующие с регуляторными белками. В начале транс­криптона, величина которого много больше оперона бактерий, находится промоторный участок, к которому присоединяется РНК-полимераза. Перемещение полимеразы вдоль транскрип­тона (и, следовательно, транскрипция) регулируется в резуль­тате взаимодействия регуляторных белков с акцепторными уча­стками. Синтезируется гигантская про-мРНК, вблизи З'-конца которой находится отрезок, соответствующий функциональной, структурной, мРНК. Затем происходит распад всей неинформа­ционной части про-мРНК, а оставшаяся мРНК переносится из ядра в цитоплазму, где и служит матрицей для синтеза белков.

Эта модель обеспечивает гораздо более тонкую регуляцию действия генов, их блокирование и деблокирование, чем в слу­чае прокариотов. Дело в том, что взаимодействие регуляторных белков и гистонов с акцепторными участками влияет на струк­туру хроматина и хромосом, определяя способ упаковки ДНК. От способа упаковки зависит возможность продвижения РНК - полимеразы вдоль транскриптона. Кроме того, и в отсутствие компактной упаковки нуклеопротеидов в растянутом транскрип­тоне присоединение регуляторных белков препятствует переме­щению РНК-полимеразы.

В составе одного транскриптона имеются различные акцеп­торные участки, узнающие различные регуляторные белки. Тем самым, разные регуляторные белки могут влиять на работу дан­ного транскриптона. И наоборот, разные транскриптоны могут узнавать один и тот же белок. Соответственно присоединение или отделение одного белка может включать или выключать целую совокупность транскриптонов.

, Структурная

TOC \o "1-3" \h \z Акцепторная зана зона

Г—— „ ,

■■ ■ і і =^ДНК

Р аг а2 а3 ak а. т s„

\

Неанфорттивная зона,

•у f 1 /' ' 1 nP°-Mm

Нуклеазы і 1 мРНК

Рис. 1.11. Схема транскриптона, р —промотор, 0[ ат—акцепторные центры, sn — структурные гены.

Большие размеры акцепторного участка ДНК и, значит, не­информационной части про-мРНК, оказываются необходимыми именно для осуществления тонкой и многообразной регуляции, без которой не мог бы существовать дифференцированный мно­гоклеточный организм. Согласно модели Георгиева, мРНК ле­жит в конце гигантской про-мРНК - Поскольку имеются акцеп­торные участки, одинаковые у разных транскриптонов, то в на­чальной части про-мРНК должны находиться последовательно­сти, одинаковые у различных про-мРНК. Это было подтвержде­но экспериментально [92].

Схема транскриптона по Георгиеву показана на рис. 1.11. Для понимания молекулярного строения транскриптона и, сле­довательно, хромосом, необходимо прежде всего исследовать взаимодействие ДНК с гистонами и негистоновыми белками. Гистоны состоят из ряда фракций — индивидуальных белков. Установлена первичная структура гистонов, выделенных из раз­личных организмов. Почти для всех фракций эта структура исключительно устойчива в эволюции. Так, гистоны Н2 из го­роха и из тимуса теленка' разнятся лишь двумя аминокислот­ными остатками из ста двух [93, 94].

Постоянство первичной структуры гистонов, возможно, опре­деляется тем, что у гистонов функциональна вся молекула: не­которые ее участки ответственны за связывание с ДНК, другие участки —за взаимодействия между белками (см., например, [95—97]). В каждой хромосоме содержатся десятки тысяч оди­наковых молекул гистона; небольшое изменение структуры ло­кального комплекса гистон — ДНК может привести в резуль­тате многократного повторения к радикальному изменению структуры хромосомы в целом. Это также может существенно ограничивать скорость изменения первичной структуры гисто­нов в процессе эволюции. Данные, характеризующие структуру гистонов, приведены в [98, 99].

Гистоны, по-видимому, образуют солевые связи с фосфат­ными группами ДНК - Весовое соотношение гистоны/ДНК в де - зоксирибонуклеогистоне из тимуса теленка составляет 1,3/1, и в среднем число основных групп гистонов примерно равно числу фосфатных групп в связанной с ними ДНК. Предположительно а-спиральные участки гистонов располагаются в бороздке двой­ной спирали ДНК; неспиральные и неосновные остатки обра­зуют петли [100]. Проведены детальные исследования конфор - мационных свойств гистонов и нуклеогистонов [101].

В ходе развития клетки конформации хромосомных белков и их ДНК-комплексов изменяются, и геном испытывает функ­циональные изменения, становясь более или менее доступным действию регуляторных белков цитоплазмы. По-видимому, глав­ная роль гистонов состоит именно в регуляции структуры хро­мосом, но не в регуляции дифференцированной транскрипции генов в клетках разного типа. В то же время установлены из­менения состава и тонкой структуры хромосомных белков на разных стадиях развития клеток и их дифференцировки. Най­дены клеточно-специфичные гистоны.

Общая ситуация достаточно сложна. С одной стороны, ги­стоны характеризуются относительно большим постоянством первичной структуры у разных видов. С другой стороны, в раз­ных клетках не только варьирует относительное содержание основных гистоновых фракций, но наблюдаются видовая и тка­невая специфичность ряда фракций. И то, и другое создает воз­можности регуляции активности генома, отсутствующие у про­кариотов, но природа этой регуляции еще недостаточно изу­чена (см. [98, і 02]).

Основная проблема молекулярной биофизики нуклеогисто­нов состоит в установлении структурных и функциональных ха­рактеристик взаимодействий гистонов с ДНК, в исследовании соответствующих явлений молекулярного узнавания. Как уже сказано, характер этих взаимодействий изменяется во время развития клеток. На гигантских хромосомах двукрылых насе­комых на определенной стадии развития появляются «пуффы»— вздутые участки, являющиеся локусами наиболее интенсивного синтеза РНК. В этих участках происходят конформационные и химические (фосфорилирование, ацетилирование, метилирова­ние) изменения гистонов, что и обеспечивает изменение функ­циональности соответствующих генов. По-видимому, в «пуф - фах» гистоны слабее связаны с ДНК, они более доступны дей­ствию протеаз и легко отделяются. Соответственно в «пуффах» гистоны не мешают работе РНК-полимеразы. В нормальных условиях гистоны препятствуют транскрипции. Синтез РНК стимулируется их удалением из изолированных фракций хро­матина.

Во всех организмах эукариотов хромосомы проходят мито- тический и, соответственно, мейотический цикл. В интерфазе митоза хромосомы невидимы в обычном микроскопе, генетиче­ский материал клеточного ядра представлен нуклеопротеидны - ми хроматиновыми нитями, наблюдаемыми с помощью элект­ронной микроскопии. В профазе хромосомы спирализуются и уплотняются, становясь хорошо видимыми в микроскопе. Даль­нейшие события при митозе состоят в удвоении хромосом (в репликации ДНК) и в их расхождении к двум полюсам, распо­ложенным на разных концах клеток. Митоз завершается деле­нием клетки [104].

Хромосомы яйцеклеток позвоночных и некоторых насекомых на определенных стадиях роста представляют собой двойные нити, в которых на небольших расстояниях друг от друга рас­полагаются вздутия, петли, именуемые хромомерами. Хромосо­мы принимают вид «ламповых щеток». На стадии «ламповых щеток» происходят интенсивные процессы биосинтеза — транс­крипция и трансляция [105]. Добавление гистонов к хромосо­мам— «ламповым щеткам» вызывает исчезновение петель и резкое ингибирование синтеза РНК [106].

Георгиев исследовал механизм ингибирования синтеза РНК гистонами методом двойной радиоактивной метки. АТФ или ГТФ, меченные Р32-фосфатом, использовались для определения инициации образования цепи, а С14-УТФ — для определения об­щей скорости ее роста. Добавление гистонов уменьшало соот­ношение С14/Р32 в синтезируемой РНК. Это показывает, что либо происходит уменьшение скорости роста цепи, либо обра­зуются сравнительно короткие цепи, т. е. гистоны мешают дви­жению полимеразы вдоль матрицы [107]. Матричная активность хроматина примерно в 10 раз меньше, чем свободной ДНК [108, 109]. Удаление определенных гистонов из хроматина увеличивает его матричную активность, причем основную роль здесь играет гистон (см., например, [110]).

Хроматин и модельные комплексы ДНК с гистонами и не- гистоновыми белками исследовались с помощью богатого арсе­нала методов, в частности, методами спектроскопии [111,112]. По-видимому, ДНК плотно упакована в дезоксинуклеопротеи - дах (ДНП), и конформация ДНК в ДНП отлична от обычной В-конформации. Из химических данных следует, что гистоны расположены в основном в широкой бороздке ДНК и вне ее [113]. Из исследований модельных комплексов следует, что ги­стоны распределяются на ДНК равномерно — участки с боль­шим содержанием гистонов чередуются с участками свободной или почти свободной ДНК [98]. Около половины ДНК «откры­то», свободно от гистонов [131].

В отличие от гистонов, негистоновые белки (НГБ) хромосом содержат не основные, а кислотные остатки. НГБ характери­зуются большой гетерогенностью — их молекулярные веса варь­ируют в широком интервале от 10 000 до 150 000. Они разнооб­разны функционально— в НГБ содержатся сложные фермента­тивные системы, в том числе полимеразы. Разнятся не только НГБ разных видов, но и разных тканей одного и того же вида [132].

Доказало, что изменение функции генов, их транскрипции в клеточном цикле сопровождается изменениями состава НГБ и их метаболизма. Стероидные гормоны, влияющие на транс­крипцию, воздействуют на НГБ. Содержание НГБ в активной форме хроматина выше, чем в неактивной. Изменения НГБ про­исходят в клетках, зараженных и трансформированных виру­сами, вызывающими рак.

Установлено, что некоторые НГБ способны узнавать специ­фические нуклеотидные последовательности в ДНК — они свя­зываются с ДНК хозяина, но не с чужеродной ДНК. НГБ сни­жают ингибирующее влияние гистонов на транскрипцию.

Таким образом, НГБ, по-видимому, регулируют активность генов на уровне транскрипции. Свойства и строение НГБ изу­чены еще недостаточно, но то, что о них известно, позволяет сформулировать гипотезу о механизме их действия ([132—134], см. также [135]).

НГБ активно фосфорилируются. Фосфорилирование и де- фосфорилирование модифицирует их свойства. Способность НГБ стимулировать синтез РНК в бесклеточной системе зави­сит от состояния их фосфорилирования. Гипотеза состоит в том, что ген включается присоединением негистонового белка к специфическому участку ДНК, репрессированному гистоном. НГБ фосфорилируется и приобретает отрицательные заряды. Поэтому он отталкивает также отрицательно заряженную ДНК и покидает ее вместе с положительно заряженным гистоном. Остается свободный участок ДНК, способной к транскрипции в РНК [132].

В хромосомах взаимодействие ДНК с белками приводит к образованию «сверхспиральной» структуры, в которой моле­кулы ДНК свертываются в хроматиды со значительным умень­шением линейных размеров. Предложен ряд моделей нуклеоги - стоновой структуры хроматина. Крик и Клуг разработали мо­дель, в которой свертывание ДНК. в хроматине определяется резкими изломами двойной спирали примерно через каждые 20 пар оснований [136]. Эта модель хорошо объясняет большую совокупность фактов.

Устройство «сверхспирали» хроматина зависит от природы и, в частности, от конформаций гистонов и негистоновых белков.

Цанев и Сендов предположили существование специфиче­ского кода для блокирования генов, считая, что кодирование определяется различными комбинациями пяти гистонов [114]. Эта гипотеза противоречит, однако, приведенным фактам, не свидетельствующим о регуляторной роли гистонов. Аргументы в пользу того, что гистоны ответственны за элонгацию цепи ДНК [115], также недостаточно убедительны.

Структура хроматина изучена недостаточно. Сведения о предлагаемых моделях и возможной связи структуры и функ­ции содержатся в ряде обзоров (см., в частности, [116, 132—134]).

В то же время идея о «втором коде», определяющем регу­ляцию транскрипции, т. е. о коде соответствия между структу­рой регуляторного белка и структурой ДНК, обоснована в ра­боте Рурского и соавторов [137]. Речь идет об универсальном коде для узнавания ДНК белком, т. е. о соответствии между аминокислотными последовательностями в стереоспецифичном участке регуляторного белка и последовательностью нуклеоти­дов в том участке ДНК, к которому этот белок присоединяется. В работе [137] предполагается, что участок регуляторного белка состоит из двух антипараллельных сегментов полипептидной цепи, образующих Р-структуру. Узнавание основано на компле­ментарное™ этой структуры и последовательности пар основа­ний ДНК - Важное свойство такой последовательности состоит в асимметричном распределении гуанинов между двумя нитями ДНК - В предлагаемом коде шесть основных аминокислотных остатков (Сер, Тре, Асп, Гис, Глн, Цис) и их последователь­ность в стереоспецифичном участке белка определяет последо­вательность пар оснований, с которой данный белок преиму­щественно связывается. Код, разработанный на основе стерео­химии, подтвержден на примере взаимодействия Лак-репрес - сора с Лак-оператором (см. стр. 40). Это единственный цока случай белково-нуклеинового взаимодействия, для которого точ­но установлены и последовательность аминокислот в белке и по­следовательность оснований в ДНК ([139, 140], см. также [142]).

В этой главе мы остановились главным образом на явлениях молекулярного узнавания, т. е. на специфических взаимодейст­виях в биомолекулярных системах. Можно считать установлен­ным, что в основе таких разнообразных явлений, как взаимо­действие антиген — антитело, рецепция запаха, регуляция био­синтеза белка в прокариотах и эукариотах, а также во взаимо­действиях клеток лежат в принципе сходные механизмы узна­вания. Именно узнавание на внутримолекулярном, межмолеку­лярном и надмолекулярном уровнях должно рассматриваться как молекулярная основа биофизики. Особо важную роль здесь играет матричный синтез. В конечном счете молекулярные взаимодействия ответственны за основные особенности живых организмов — за ферментативный катализ биосинтез белка и за регуляцию того и «другого, за мембранный транспорт молекул, ионов и электронов, за механохимические процессы. Мы постоян­но будем встречаться с этими взаимодействиями в последующем изложении.

Описанные в §§ 1.6 и 1.7 явления регуляции не стали еще предметом детальных физических исследований. Для этого по­ка не хватает биологической информации. Однако общие физи­ческие принципы регуляции намечены. В то же время уже уста­новленные факты позволяют подойти к построению физико-ма­тематических моделей регуляторных процессов (см. гл. 9).