ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН — АНТИТЕЛО

Иммунологическая защита организма позвоночного живот­ного от чужеродных белков и других биополимеров, именуемых в этом случае антигенами, в конечном счете сводится к взаимо­действию специфических белков — антител — с антигенами. Им­мунный ответ, т. е. появление антител в организме, есть резуль­тат узнавания антигенов определенными популяциями клеток. Этот процесс развивается на организменном уровне, в нем уча­ствуют различные клеточные узнающие системы, являющиеся обучающимися в том смысле, что они приобретают память об однажды введенном антигене и отвечают на его вторичное вве­дение усиленной выработкой антител. Эти важные процессы, имеющие непосредственное отношение к общей проблеме кле­точной дифференциации, рассмотрены в § 9.11. Здесь мы оста­новимся на структуре антител и антигенов и их взаимодей­ствиях, определяющих молекулярное узнавание.

Антитела (AT) представляют собой белки, относящиеся к группе иммуноглобулинов. У человека имеется пять основных классов иммуноглобулинов, обозначаемых IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, в свою очередь разделяемых на подклассы [15]. Важней­шими являются IgG. Их молекулярный вес равен примерно 150 000, константа седиментации 75. IgM имеют молекулярный вес (9—10) - 10s, константу седиментации около 195. IgM, по - видимому, представляют собой пенгамеры IgG.

С помощью ряда химических и физико-химических методов установлена схема строения макромолекулы IgG [16, 17]. На рис. 1.1 показана схема строения IgG кролика по Портеру [15, 18]. Молекула состоит из двух тяжелых цепей, обозначаемых у,

,|К_п±±з с Я/Х

У

B {tttLI I r"s"s~l l"s"s~1 с Y

S

L—s-s—1 c?

X

"T=S+3 I—S~S—І в X, A

Рис. 1.1. Схема строения антитела IgG по Портеру.

И двух легких, обозначаемых в зависимости от типа AT к или К. Их молекулярные веса равны соответственно 53 500 ±4000 и 23800 ± 100С (кролик), а числа аминокислотных остатков 446 и 214 (последние числа относятся к миеломному белку человека IgG, первичная структура которого была полностью расшиф­рована [19]).

Белковые цепи в молекуле IgG связаны дисульфидными мос­тиками, показанными на рис. 1.1.

Структура молекулы IgG была установлена, в частности, в результате ее расщепления на отдельные полипептидные цепи иод действием различных химических агентов и протеолитиче - ской фрагментации. Схема фрагментации IgG папаином, уста­новленная Эдельманом, показана на рис. 1.2 [15].

AT к самым различным антигенам (АГ) характеризуются принципиальным единством строения — схема, приведенная на рис. 1.1, универсальна. Исследование первичной структуры по­липептидных цепей IgG показало закономерное расположение внутрицепочных S—S-связей, изображенных на рис. 1.1. При­мерно на каждые 100 остатков приходится один дисульфидный

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Fab ^ - - ) Fnb

J-ao ^ - / D )

(EX>

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Х, Л

Рис. 1.3. Схема доменной структу­ры IgG по Эдельману.

Рнс. 1.2. Схема фрагментации IgG папанном по Эдельману.

Мостик, формирующий петлю, содержащую примерно 60 остат­ков. Такой участок с петлей, согласно предположению Эдель - мана, представляет собой компактную глобулу, названную до­меном [19]. Схема доменной структуры IgG приведена на рис. 1.3.

AT к различным АГ харак­теризуются различиями пер­вичной структуры. Эти разли­чия локализованы в совершен­но определенной области мак­ромолекулы IgG — в вариа­бельной, или У-области. Ва­риабельная область занимает

Примерно половину Fab фрагментов папаинового протеолиза (см. рис. 1.2), т. е. в нее входит около половины легкой цепи и половины прилежащего участка тяжелой цепи у их N-концов. Соответствующие домены на рис. 1.3 отмечены буквой V. Пер­вичные структуры остальных областей тяжелых и легких цепей постоянны в пределах данной группы IgG. У человека длина V-областей и-цепей варьирует от 107 до 112 остатков, длина по­стоянной С-области равна 107 остаткам [15].

Из сказанного следует, что именно ^-области ответственны за взаимодействие AT — АГ, поскольку специфичность AT опре­деляется особенностями первичной структуры. Активный центр AT, в котором локализовано взаимодействие AT — АГ, должен
содержать V-область и действительно, как показано прямыми опытами, он расположен в Fab фрагментах [20]. Симметричная структура IgG, т. е. наличие двух тождественных /^-фрагмен­тов, указывает на то, что IgG имеет два активных центра, т. е. «валентность» AT равна двум (см. стр. 23).

Антигенами являются биополимеры, прежде всего белки и по­лисахариды. В 1919 г. Ландштейнер открыл прекрасный способ получения искусственных синтетических АГ [21]. Метод основан на соединении диазотированных ароматических аминосоедине - ний с тирозилом белка в слабощелочном растворе. Схема реак­ции Ландштейнера следующая:

NH R—/ \ N=NX"

НО—/ ^—СН2—СН *

Іо

Щелочь

I

I

NH

НО—^ ^—СН2—СН - N=V СО

Таким способом можно ввести в белок в принципе любой ра­дикал R. R-фенилазобелок можно использовать в качестве АГ и стимулировать выработку соответствующих AT.

Сопоставление иммунологических свойств радикалов R, при­соединенных к белкам, и самих белков показало, что фактором, определяющим антигенную специфичность, является радикал R, а белок играет второстепенную роль. Это было доказано пере­крестными реакциями. AT, полученное в результате воздействия антигена R — Б (Б — белок), реагирует с другим антигеном R — Б' (Б' — другой белок), но не реагирует с антигеном R'—Б (R' — радикал, отличный от R). Антиген R — Б дает с соответствующим AT труднорастворимый осадок. Если добав­лять к системе R-антиген — R-антитело малые молекулы, содер­жащие ту же детерминантную группу R, например,

То реакция тормозится, а при дальнейшем повышении концен­трации низкомолекулярного соединения прекращается вовсе. Такого рода малые молекулы не создают антител в организме подопытного животного и, следовательно, не являются антиге­нами. Однако они взаимодействуют с ранее возникшими антителами, образуя растворимые соединения. Это — гак называемое гаптеновое действие, а указанные малые молекулы называются гаптенами. Гаптены конкурируют с АГ, взаимодействуя с теми же активными областями AT. Взаимодействие подобно обычной химической реакции и подчиняется закону действия масс. АГ со­держит детерминантную группу и высокомолекулярный носи­тель, а гаптен — только детерминантную группу. Исследование иммунохимической реакции показывает, что природные АГ со­держат ряд детерминантных групп и в этом смысле полива­лентны.

В дальнейшем было показано, что AT не только полива­лентны в смысле наличия нескольких тождественных групп, узнающих АГ, но могут быть и полифункциональными. Уста­новлено, что некоторые AT взаимодействуют с несколькими АГ, структурно сильно различающимися. Это имеет существенное биологическое значение [117].

(П) (III)

Спрашивается, какие свойства детерминантных групп опре­деляют их взаимодействие с антителами? Выясняется, что суще­ственно пространственное строение детерминантной группы. Ис­кусственный АГ типа

Гли—СО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Вызывает образование двух типов антител к антигенам (II) и (III) Гли—СО

( і—N=N—Белок,

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

N=N—Белок,

Лей—СО

Но не к антигену (I), как целому. Это показывает, что размеры детерминантных групп и адекватных им реактивных участков антител относительно невелики [22].

Наличие реактивных групп (активных центров) в AT непо­средственно доказывается красивыми опытами Прессмана и Штернбергера [23]. Кролик иммунизировался искусственными АГ, содержащими в качестве детерминантных групп остаток п-азобензойной

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

W

Ноос

•N=N—Белок

И и-азофениларсиновой кислот

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

H203AS—

~N=N—Белок.

Полученные AT подвергались йодированию, чем полностью по­давлялась их иммунологическая активность. Однако, если йоди­рование проводилось в присутствии гаптенов, то активность со­хранялась. Отсюда следует, что введение йода в активную об­ласть AT уничтожает ее активность, а гаптен защищает эту область от йода. Сказанное изображено схематически на

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Гаптен

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Рис, 1.4. Схема йодирования антител.

Активно

Рис. 1.4. По-видимому, между активной областью, с одной сто­роны, и гаптеном или детерминантной группой АГ — с другой, имеется структурное соответствие. Гаптен конкурирует с детер­минантной группой за место в активной области антитела. Срод­ство AT к гаптену, структурно сходному с детерминантной группой, определяется либо методом равновесного диализа, либо по торможению реакции преципитации антигена антителом при различных концентрациях гаптена.

Была изучена методом электронной микроскопии [24]. На рис. 1.5, а показана электронная микрофотография комплекса

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

''ШММИ^ШЯ^ЯШ Ш'ШШШЯАі

Рис. 1.5. Электронные микрофотографии комплекса АГ с AT (а) и ком­плекса АГ с AT, обработанным пепсином (б).

АГ с AT, а на рис. 1.6 — схема, основанная на ее интерпретации [17]. Двухвалентные AT, взаимодей­ствуя с двухвалентными же ДНФ, образуют циклы. Молекулы ДНФ не видны на микрофотографии, вы­ступы у вершин треугольника, по - видимому, являются фрагмента­ми Fc.

Предварительная обработка AT пепсином приводит к отщеплению Fc, но остаются фрагменты Fab, по - прежнему дающие циклические ком­плексы с ДНФ, но уже без высту­пов (рис. 1.5,6).

Взаимодействие AT с гаптеном (Г), как уже сказано, подобно взаимодействию с соответствующими АГ. Константа равновесия реакции

АТ + Г ^ AT • Г

Выражается как

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Рис. 1.6. Комплекс антиген —

Антитело. Схема, основанная на электронных микрофотографиях; «гантель» — мо­лекула ДНФ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Структура комплекса AT с соответствующим двухвалентным (бифункциональным) динитрофенильным гаптеном (ДНФ)

4no2

0,n -

[AT-Г] ... Т AS — ДЯ

Для определения К пользуются гаптенами, окрашенными или меченными радиоактивными атомами. Величину К можно найти и по торможению реакции AT с АГ (преципитации). По темпе­ратурной зависимости К определяют значения АН, примерно равные нескольким ккал/моль; значения AS, как правило, по­ложительны. Последнее можно объяснить освобождением гидра - тирующих молекул воды при образовании комплексов.

Анти Анти АнпМ

О-йЗйбензоларсоная) м-аЗоВензтрша/rf п-азобензоларфяап?

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

Рис. 1.7. Влияние положения заместителя на значение К' для гаптена

(по Прессману).

К' 10,0

Го

V!

Ц05

Детальные исследования зависимости констант связывания от структуры Г или соответствующей детерминантной группы АГ были проведены Полингом, Прессманом и их сотрудниками [25—27]. В частности, были получены AT к ионам орто-, мета-, пара-азобензоларсоната. Антитела к каждой из этих групп дей­ствуют так, как если бы они вступали в структурное соответ­ствие с ван-дер-ваальсовой поверхностью детерминантной груп­пы. Взаимодействие таких AT с другими замещенными азобен - зольной группы определяется исходным АГ. На рис. 1.7 приведе­ны результаты, полученные для таких трех систем — даны значе­ния относительной константы связывания К', равной отношению константы связывания замещенного бензоларсоната к константе связывания незамещенного бензоларсоната в этих системах [27].

Антитело к орго-азобензоларсонату связывает орго-замещен- ные, слабее лгега-замещенные и хуже всего пара-замещенные.

В табл. 1.3 приведены результаты исследования ряда пара- систем [27]. Были получены AT к различным гаптеновым груп­пам. Звездочка указывает гомологичную заряженную группу, числа — относительные константы связывания гомологичного гаптена с антителом (для производных бензола принято значе­ние этой константы, равное 1,0).

Для AT к орго-азобензоату

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО

—N=

Относительные константы связывания иара-гаптенов R—С6Н4— — С02~ равны для ряда R = Н, F, CI, Br, I соответственно 1,00, 0,6, 0,5, 0,4, 0,5.

Эти данные показывают, что для образования связи AT—АГ или AT—Г необходимо достаточно точное соответствие актив­ного участка AT с поверхностью гаптеновой группы. Чрезвы­чайно существенно относительное расположение компонентов гаптеновой группы. Для AT к пара-NN—С6Н4—As03H относи­тельные константы связывания 0As03H, H3CAs03H, H5C6As03H" и H5C6CH2As03H соответственно равны 0, 0, 1, 0. Удаление бензольного кольца (необходимого для связывания) от арсоната на одну метальную группу СН2 уничтожает свя­зывание [27].

Связывание сильно зависит от природы заряженной группы. Так, те же AT к пара-NN — СбН4 — As03H~ одинаково сильно связывают СбН5Аз03Н~ и СбН5Р03Н~, но не связывают C6H5SO^, C6H5COJ" и СбН55Ь05Н4~. Существенное значение имеет радиус иона.

Описанные результаты и другие данные, им подобные, сви­детельствуют о комплементарное™, о структурном соответствии активного участка AT и детерминантной (гаптеновой) группы АГ. Очевидно, что размеры активного участка AT должны быть соизмеримы с размером гаптена. Методом торможения реакции AT с АГ были исследованы взаимодействия AT к поли-Ь-аланину с олигопептидами аланина. Оптимальным гаптеном, сильнее всего тормозящим реакцию, оказался пентапептид. На этом основании размеры активного участка были оценены в 25 X X 11 X 2 А3 [28]. Считается, что вообще в активных участках фигурируют 10—20 аминокислотных остатков, т. е. около 1% всех остатков молекулы AT. Следует отметить, что число остат­ков в активном центре фермента того же порядка, но мономерные

Таблица 1.3

Гаптены

Система

*

!

*

0

Ch3

*

Cr

*

CO

*

-nn-Q

N(CH3)2

1,0

1,45

0,86

1,05

2,0

—NN—^ У—NN—^

As03H"

1,0

2,7

1,1

1,1

2,9

3,9

-nn-Q

As03H-

1,0

1,9

0,78

0,21

0,52

6,0

COO"

1,0

1,8

0,21

0,03

0,03

1,98

-nn-Q

COO"

1,0

3,0

0.66

0,08

0,18

10

Связывание в различных пара-системах

Молекулы ферментов, как правило, значительно меньше моле­кул антител.

При денатурации антител их способность к специфическому связыванию АГ или Г исчезает. Однако удается в некоторых случаях осуществить и ренатурацию антител с восстановлением их активности. Присутствие гаптена способствует ренатурации.

Значения свободных энергий связывания, стерическое струк­турное соответствие активного центра AT и гаптеновой группы, оценки размеров активных центров показывают, что взаимодей­ствие AT с гаптеном весьма сходно по характеру с взаимодей­ствием фермента с субстратом, приводящим к образованию ми - хаэлисова комплекса ([1], гл. 6). Естественно возникает вопрос о конформационных свойствах антител, о информационных превращениях в акте взаимодействия.

Было показано, что папаиновые фрагменты IgG характери­зуются большей компактностью, чем молекула в целом [29]. Это указывает на конформационное превращение. Различные про - теазы разрывают тяжелую цепь в одном и том же участке. Можно думать, что этот участок неупорядочен и служит своего рода шарниром. Электронные микрофотографии комплексов AT — Г, подобные приведенным на рис. 1.5, показывают, что углы между Fab-фрагментами могут изменяться. Все эти дан­ные свидетельствуют об известной гибкости молекул IgG. Пря­мые доказательства конформационной лабильности молекул IgG и IgM были получены путем изучения поляризованной лю­минесценции (см. [1], § 5.8). Время вращательной релаксации х комплексов IgG с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилом (ДНС, дансил) было оценено в 170—220 не [30, 31]. Близкое значение т дал расчет, основанный на моделировании IgG же­стким эллипсоидом вращения. Однако в более точных исследо­ваниях было получено х = 60 не [32]. Это значение соответ­ствует броуновскому движению не всей молекулы белка, но ее относительно малых участков, т. е. указывает на гибкость мо­лекулы. Значения т для отдельных Fab - и /-с-фрагментов равны соответственно 64 и 33 не. При их свободной связи среднее т должно составлять 56 не, что хорошо согласуется с найденными Для целой молекулы значениями. По-видимому, субъединицы IgG, сходные с папаиновыми фрагментами, обладают свободой вращения [33—35]. Взаимодействие гаптена с AT приводит к за­метному увеличению т, что свидетельствует об изменении кон - формации AT [36]. С другой стороны, методом кругового ди­хроизма установлено, что при образовании комплекса А Г — АГ изменяется и конформация АГ [37]. Результаты оптических из­мерений подтверждаются и исследованиями спектров ЭПР анти­тел, содержащих парамагнитные метки ([38]; детальный обзор и дальнейшие подробности см. в [15, 39]).

Таким образом, конформационные перестройки действи­тельно реализуются при взаимодействиях AT — АГ. Есть осно­вания думать, что они сводятся к изменению взаимных ориен - таций доменов. В этом отношении также имеется сходство с фермент-субстратными комплексами. Принципиальное отли­чие взаимодействия AT — АГ от взаимодействия фермент — суб­страт состоит в том, что в первом случае практически отсут­ствуют электронные перестройки. Соответственно речь идет о чисто конформационных эффектах, но не об ЭКВ. В этом смысле первый случай значительно проще второго.

Узнавание антигена антителом определяется слабыми взаи­модействиями, реализуемыми при структурном соответствии. Узнается сигнатура АГ — его детерминантная, гаптеновая группа. Результатом узнавания является связывание АГ, но не химическое превращение (как в случае фермента).

В свое время Полинг выдвинул идею, согласно которой узнающая система антитела способна к обучению [40]. Полинг считал, что все молекулы AT имеют одну и ту же первичную структуру. Специфические AT образуются в результате конфор - мационного свертывания полипептидных цепей, индуцируемого молекулами АГ, и достижения таким образом структурного со­ответствия. Однако в дальнейшем было показано, что первич­ные структуры различных AT разнятся. Подобно ферменту, им­муноглобулин— необучаемая узнающая система.

ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

ЗРЕНИЕ

Воздействие света на живые организмы не ограничивается фотосинтезом. Гетеротрофные организмы для своего существо­вания должны получать информацию о пище, а на более высо­ких уровнях развития и о других факторах жизни, связанных …

ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ В МЕМБРАНАХ

Мембраны клеток и внутриклеточных органоидов в значи­тельной степени определяют их свойства. Естественно думать, что и периодические процессы, присущие живым организмам, связаны с периодическими явлениями в мембранах. Нелинейное поведение возбудимых мембран …

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Биоэнергетические процессы, приводящие к синтезу АТФ, к зарядке «биологических аккумуляторов», протекают в специали­зированных мембранах митохондрий. Именно здесь локализо­ваны и пространственно организованы молекулярные системы, ответственные за энергетику живых организмов. Синтез АТФ …

Как с нами связаться:

Украина:
г.Александрия
тел. +38 05235 7 41 13 Завод
тел./факс +38 05235  77193 Бухгалтерия
+38 067 561 22 71 — гл. менеджер (продажи всего оборудования)
+38 067 2650755 - продажа всего оборудования
+38 050 457 13 30 — Рашид - продажи всего оборудования
e-mail: msd@inbox.ru
msd@msd.com.ua
Скайп: msd-alexandriya

Схема проезда к производственному офису:
Схема проезда к МСД

Представительство МСД в Киеве: 044 228 67 86
Дистрибьютор в Турции
и странам Закавказья
линий по производству ПСВ,
термоблоков и легких бетонов
ооо "Компания Интер Кор" Тбилиси
+995 32 230 87 83
Теймураз Микадзе
+90 536 322 1424 Турция
info@intercor.co
+995(570) 10 87 83

Оперативная связь

Укажите свой телефон или адрес эл. почты — наш менеджер перезвонит Вам в удобное для Вас время.