ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

МОДЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ АКТИВНОГО ИОННОГО ТРАНСПОРТА

Поддержание постоянной разности электрохимических по­тенциалов между цитоплазмой и внешней средой требует актив­ного транспорта ионов в направлении, противоположном направ­лению падения потенциала. Неравновесная термодинамика та­кого процесса изложена ранее.

Активный поток Na+ из клетки зависит от внутриклеточной концентрации натрия с1Ыа [38, 39] и внеклеточной концентрации калия с« [39, 40]. Кривые JNa(c'Na) и /к(с£) имеют S-образную форму. Эти факты, а также ряд других требуют объяснения.

Как уже сказано, источником свободной энергии для поддер­жания активного транспорта является АТФ (см. стр. 119). АТФ усиливает активный транспорт, будучи введена внутрь клетки, но не влияет на него, находясь во внешней среде [41]. Из кле­точных мембран удалось выделить К, Na-эктивируемую АТФ - азу [42]. Этот фермент расщепляет АТФ только в присутствии К+ и Na+. Действие АТФ в мембране непосредственно связано с активным транспортом — глюкозид оубаин ингибирует АТФ - азу при той же концентрации, при которой он прекращает ра­боту натриевого насоса. Гидролиз АТФ in vitro с помощью этой АТФ-азы происходит в две стадии [43]. Вначале выделяется АДФ, а неорганический фосфат остается связанным с фермен­том. Эта стадия активируется ионами Na+. Второй этап требует присутствия К+ и состоит в отщеплении фосфата от фермента. Сходная, но уже пространственная асимметрия свойственна на­сосу— на внутренней поверхности мембраны его активность за­висит от на внешней — от [44]. При расщеплении АТФ на мембранах наблюдается переход меченого фосфора из АТФ в фосфопротеиды мембраны [45, 46]. Кинетика действия АТФ - азы in vitro характеризуется S-образной зависимостью скорости реакции от концентраций Na+, К+ и АТФ [47]. Гидролиз одной молекулы АТФ в мембране сопровождается выходом из клетки двух — трех ионов Na+ [48].

Для согласования всех этих фактов и их объяснения предла­гались различные модели натриевого насоса. В модели Опита и Чарнока [49], основанной на структурной модели мембраны, предложенной Даниэлли и Давсоном (см. далее, стр. 137), бе­лок мембраны, расположенный на ее внутренней поверхности, приобретает АТФ-азную активность под действием Na+ и фос - форилируется при расщеплении АТФ:

Na+ • АТФ + Е Na+ • Е • Ф + АДФ.

В результате фосфорилирования происходит резкое конформа- ционное превращение белка, поворот макромолекулы, вынося­щий занятые Na+ ионообменные центры к внешней поверхности мембраны, причем Na+ заменяется на К+:

Na+ • Е • Ф + К+ К+ • Е • Ф + Na+.

Комплекс фосфопротеида с К+ гидролизуется, отщепляется фос­фат и молекула белка возвращается в исходное состояние:

К+ • Е • Ф Е + Ф + К+.

Обратный конформационный переход, обратный поворот моле­кулы вносит ионы внутрь мембраны. Оубаин ингибирует именно последнюю стадию. Таким образом, в этой модели АТФ-аза рас­сматривается как конформационный переносчик. Модель являет­ся качественной и не подкреплена расчетами. Ее достоинство состоит в том, что она учитывает сочетание ферментативной

В* реакции с ионообменной и кооперативный характер процесса. Но предложенный механизм представляется искусственным, так как он требует перемещения больших участков макромолекулы от одной поверхности мембраны к другой. Экспериментальные под­тверждения такого перемещения отсутствуют. В работе [50] ко­личественно проанализирована модель с участием переносчика, который может находиться в нескольких формах. Теория эта исходит из частных предположений и вводит в'расчет 19 неза­висимых параметров. Поэтому ее нельзя проверить эксперимен­тально. В работе [51] рассмотрена модель с двумя переносчи­ками, в работе [52] — модель функционирования активного цент­ра К, Na-активируемой АТФ-азы. Были получены некоторые сведения об этом ферменте. По-видимому, он представляет со­бой тетрамерный белок с молекулярным весом около 250 ООО и содержит два типа субъединиц аир (молекулярные-веса 84000 и 57 000) по две каждого сорта. Лишь субъединицы а присоеди­няют фосфорную метку из меченой АТФ [53, 54]. Исходя из этого, Штейн и соавторы предложили конкретную модель ак­тивного транспорта, определяемого информационными превра­щениями АТФ-азы [55]. Переход из одной конформации в дру­гую вызывает изменения сродства к катионам соответствующих активных центров. В одной конформации а-субъединица связы­вает Na+ и р-субъединица связывает К+, в другой — наоборот. Конформационное превращение сопровождается гидролизом АТФ, отщепленный фосфат первоначально присоединяется к а - субъединице. В работе [52] аргументируется участие трех ами­нокислотных остатков в этом процессе: Глу, Гис и Сер.

Рассмотрим подробнее кинетическую модель, предложенную в работе [56]. Предполагается, что имеются два типа активных центров, способных присоединять и обменивать Na+ и К+. Пер­вый тип центров неспецифичен, эти центры участвуют в пассив­ном транспорте (см. § 3.5). Центры второго типа принадлежат АТФ-азе и обеспечивают активный транспорт. Перемещение ио­нов происходит по эстафетному механизму.

Фермент катализирует гидролиз АТФ. Обозначим АТФ бук­вой X, АДФ (или АМФ) — Z и фосфат — Ф. Связь ионообменной реакции с ферментативной запишем в виде

Na' + Ег • К + X А Ег • Na • Ф + Z + Кг. ъ-\

Индекс і по-прежнему относится к внутренней стороне мембра­ны, е — к внешней. На внешней стороне

Ке + Ее • Na • Ф & Ее • К + Ф + Na®.

— 2

Комплекс Na-Ф, распадающийся на внешней стороне мембраны, перемещается к ней от места своего образования по градиенту
концентрации. Если сродство обменных центров к ионам велико и свободные центры отсутствуют, то перемещение комплекса Na • Ф и обмен на К можно представить в виде обменной реакции

Е' • Na • Ф + Е® • К ^ Е' • К + Е® • Na. ф.

К-3

Таким образом, обобщенная сила, переме­щающая ионы, — разность химических по­тенциалов продукта Z, которая поддержи­вается ферментативной реакцией.

Предположим далее, что обмен на фер­ментных центрах и ферментативная реак­ция происходят кооперативно. Иными сло­вами, центры взаимодействуют друг с дру­гом таким образом, что обмен лиганда про­исходит практически одновременно на не­скольких центрах. Такой кооперативный обмен наблюдается, например, в цеолитах [57], где он определяется изменением структуры решетки вслед­ствие обмена ионов. Соответственно введем в уравнения реак­ций стехиометрические коэффициенты, не равные 1. Общая схема реакций имеет вид

ANa' + E'-Kg + YX Ег • Naa • Yv + РК' + yZ

'N. Jf *-3Jf*3 *з|*-з f'K

A Na® + E® • KB + VY E® • Naa • Yv + PK®.

— 2

Здесь /Na и /к — пассивные потоки, а, р, y — стехиометрические коэффициенты. Сопряжение направленных потоков изображено на рис. 3.6. Кинетические уравнения написанных реакций имеют вид

Т = - Ка)° Ы* 4 + А-І (4)Є (<*)' 4а. Т fiNa = — К.)в (Cx)V 4 + A-I (4)6 ЫЧа + /N.; "s"<5Na== Піі& ' ^-2(CNa) (Cy)V 4 ' ^Na> (3.122)

Рис. 3.6. Сопряжение ионных потоков в мем­бране с химической реакцией (Y—фосфат).

Tdk = k 1 (4аГ (^x)V 4-^-1 (4)0 (Cz)V 4a + 4 ^= - kX (CNa)a (<x)V 4 + (4)P Ы 4a +

Где cljt с* — безразмерные концентрации, т. е. молярные кон­центрации иона сорта j внутри и вне клетки, отнесенные к мо­лярным концентрациям воды в соответствующих объемах сн, о> сн2о"> п/> — числа занятых ионами обменных мест фер­мента на единицу площади внутренней и внешней поверхности мембраны, S — площадь мембраны. Одновременно

4 + Пк = П'> ПК + ttNa = п" (3-123)

И

Snk + SnK + сн2оск + сн2оск ~ пк> | ^ ^

Соотношения (3.123) и (3.124) выражают сохранение числа об­менных центров на поверхностях мембраны и полного числа ио­нов каждого сорта.

В стационарном состоянии правые части (3.122) равны нулю. В клетке расходуется только вещество X (АТФ).

Из двух первых уравнений (3.122) следует, что активный выход Na+ из клетки определяется скоростью реакции сх и в стационарном состоянии компенсируется пассивным потоком

Считая ферментативные реакции необратимыми, положим k-i = k-2 — k-3 = 0. В этом приближении активный поток Na+ из клетки равен

1 = К Ка)° (<x)V < = К (Ск)Р ^ ShnLnb (3-125)

Считая концентрации ионов Na+ и К+ в растворах независи­мыми друг от друга, получаем отсюда

СГ = Г /(/.-/)-IV r3.2fiv

См- +*,(*?) J°°-J J ' ( }

Т. е. Сца выражена как функция потока J при заданных с®, сх. Здесь

'о = Vе Kf> = K)7(s Vі + К Kf)-

Анализ (3.126) показывает, что кривая c^a(f) имеет один перегиб в интервале 0 < / < /«=, что согласуется с опытом [56]. То же относится и к с|(7). Если а = р= 1, т. е. отсутствует кооперативное взаимодействие между активными центрами фер­мента, то перегиба нет. В этом смысле АТФ-азная реакция по­добна другим ферментативным процессам.

Описанная кинетическая модель согласуется с опытом и по­казывает, что специфическая роль белка-фермента в мембран­ном транспорте состоит в сопряжении транспорта с метабо­лизмом.

Мы не обсуждали пока конкретные пути переноса ионов через мембраны. Законно поставить вопрос о реализации пере­носа через поры, каналы в мембране или посредством специаль­ных переносчиков [58]. Ходжкин впервые выдвинул предположе­ние о «натриевых» и «калиевых каналах» [59]. Очевидно, что последовательность соответствующих ионообменных центров также может трактоваться как канал. Однако существование каналов доказывается и непосредственно (см. [58, 183, 184]).

Оказалось, что клеточные мембраны проницаемы не только для воды и ионов, но и для ряда нейтральных молекул, рас­творимых в воде, но не растворимых в липидах (см., например, [60]). В возбудимых мембранах (см. гл. 4) существуют специа­лизированные ионные поры, проницаемость которых зависит от природы ионов [61]. Селективность каналов велика, но не абсо­лютна. Так, отношения проницаемостей Рщт/Рпа для натриевых каналов перехвата Ранвье (см. стр. 161) для гидроксиламина 0,94, для Li+ 0,93, для NHJ 0,16, для К+ 0,09. Для калиевых каналов P„0,i/PK для Т1+ 2,3, Rb+ 0,91, NH4+ 0,13, Cs+ 0,08, Na+ 0,01 [62] (дальнейшие подробности см. в [58]). Блокирование каналов другими ионами позволяет получить информацию о функциональной «архитектуре» каналов.

В работе [63] предложена теоретическая модель канала в двойном слое липидов (см. стр. 137). Предполагается, что на стенках канала имеются кооперативно действующие активные центры. Переносимый ион подвергается действию силового поля и свободно движется вдоль канала. Движущиеся ионы могут трактоваться как ионный газ.

Прямое доказательство наличия каналов состоит в том, что в отсутствие проникающих ионов Na+ и К+ высокочастотная проводимость мембраны равна нулю. Если бы в ней функциони­ровали подвижные заряженные группы, то должен был бы наблюдаться электрический ток. Удается оценить количествен­ные характеристики каналов, число которых, приходящееся на 1 мкм2 мембраны, составляет несколько сот. Так, проводимость одиночного натриевого канала 4-Ю-12 Ом-', калиевого — 12-Ю-12 Ом-1 [185]. Сечение Ыа+-канала — примерно З X 5 А2, пропускная способность—107 ион/с. Ионный канал можно трак­товать как своего рода «векторный фермент», катализирующий перенос иона. Активность этого «фермента», несомненно способ­ного к конформационным перестройкам, регулируется электри­ческим полем [184].

В серии работ [186] проведено сопоставление перескокового и электродиффузионного механизмов движения частиц в тонких мембранах.

Проблемы активного транспорта, описанные здесь, имеют непосредственное отношение к возбудимым мембранам. Рассмот­рение свойств этих мембран в связи с генерацией нервного им­пульса приведено в гл. 4.