ФИЗИКА ЖИЗНЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

КОНФОРМАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН

До сих пор мы говорили о статическом строении мембран и не рассматривали их динамические свойства, их фазовое со­стояние.

Ряд фактов свидетельствует о большой лабильности мем­бранной структуры [75, 89—92]. Липиды мембраны обладают высокой подвижностью и должны рассматриваться как жидкие кристаллы. Еще в 1933 г. Бернал писал, что свойства жидких кристаллов «как раз те свойства, которые требуются на уровне организации, промежуточном между непрерывным веществом, жидким или твердым, кристаллическим веществом и простейшей живой клеткой» [93]. В жидком кристалле реализуется сочета­ние текучести и лабильности при наличии преимущественной ориентации.

Жидко-кристаллические (жидкостные) свойства мембран определяются тем, что липиды в них находятся при физиологи­ческой температуре в расплавленном состоянии. Как мы увидим, расплавлены углеводородные цепи. Температура плавления угле­водорода тем ниже, чем больше двойных связей он содержит при прочих равных условиях (вспомним различие между живот­ным и растительным маслом). Липиды, содержащие в углеводо­родных цепях ненасыщенные двойные связи, плавятся при тем­пературах ниже физиологических. В плазматических мембранах млекопитающих доля таких липидов велика.

Жидкостные свойства мембран доказываются многими фак­тами. Установлено, что в некоторых клетках поверхностные ан­тигены свободно диффундируют в мембране. Подвижность мем­бранной структуры обнаруживается с помощью парамагнитных [94] и флуоресцентных меток [95, 96], а также методом ЯМР - спектроскопии [97]. На рис. 3.8 показаны результаты исследова­
ния подвижности мембран методом электронной спин-резонанс - ной спектроскопии. Нитроксильная спиновая метка присоеди­няется к хвосту липидной молекулы, которая вводится в двой­ной липидный слой мембраны.

CHg CHg СН 2 СН2 СНг CHg СН^ CHg н„с С

О а и • и о

НО^-с

Рис. 3.8. Спектры ЭПР спин-мече­ной молекулы липида, помещен­ной в мембрану.

1 — низкая температура, 2—высокая температура.

II о

Спектр ЭПР при низкой температуре показывает, что липид заморожен, при высокой он оказывается расплавленным и спектр становится острее (см. [68]).

Как писал Брайтон (см. [80]): «Мы начинаем представлять себе море липидов, в котором плавают другие молекулы. Мы узнаем большую подвижность компонентов мембраны, испыты­вающих непрерывную реоргани­зацию». Наибольшей подвижно­стью как конформационной, так и трансляционной обладают уг­леводородные «хвосты» липид - ных молекул в матриксе мембра­ны [89, 98].

В 1973 г. на страницах жур­нала «Science» была опублико­вана дискуссия по вопросу о жидкостных свойствах мембран. Олдфилд в статье под заглавием «Жидки ли клеточные мембра­ны?» [99] привел доказательства того, что значительная часть ли­пидов в мембранах ряда микро­организмов (возможно, тех, в которых нет холестерина) нахо­дится в твердом гелеобразном со­стоянии. Синджер начал свой ответ на эту статью словами: «Да, мембраны жидкие» [100]. Он подчеркнул, что в тех случаях, о которых пишет Олдфилд, не все липиды находятся в мембране в твердом состоянии.

Особенно детально изучены жидкостные свойства фоторецеп- торных мембран (см. § 7.10). Фоторецепторные мембраны па­лочек содержат практически лишь один белок—- родопсин. Одна
молекула родопсина в мембране приходится на 60—90 молекул липидов, из которых 80% содержат ненасыщенную жирную кис­лоту [101]. Методом вспышечной фотометрии установлено, что молекула белка испытывает быстрое вращение вокруг оси, пер­пендикулярной к плоскости мембраны. Время такой вращатель­ной диффузии 20 мкс при 20 °С [102]. Изучение взаимодействия родопсина со светом (выцветание, см. § 7.9) методом микро - спетрофотометрии показало, что в мембране происходит и транс­ляционная латеральная диффузия родопсина. Коэффициент диф-

Рис. 3.9. Современная схема строения клеточной мембраны [68]. а, б, в, г, д, е — различные белковые молекулы.

Вязкости мембраны от 1 до 4 П [103]. Это согласуется по по­рядку величины с вязкостью, определенной по трансляционной диффузии, в мембранах клеток млекопитающих [104] и в мембра­нах митохондрий и нервных аксонов [105, 106]. Таким образом, вязкость мембран на два или три порядка выше вязкости воды и соответствует вязкости растительного масла.

Текучесть мембран непосредственно наблюдалась при мик­роскопическом изучении простейшего Cryptotermes [107].

Изложенные факты позволили построить динамическую мо­заичную модель мембраны [65, 75, 91, 108—111]. Ее схематиче­ское изображение дано на рис. 3.9 [68]. Белки «плавают в ли - пидном море». Их молекулы погружены с двух сторон мембраны и а разную глубину в двойной слой подвижных углеводородных «хвостов» липидов; имеются белки, проходящие через всю мембрану. Строение мембраны асимметрично. Значительная ч^сть поверхности мембраны свободна от белков — так, белки занимают 70% поверхности мембраны эритроцита и 80% по­верхности мембраны микросомы [112]. В фоторецепторных мембранах родопсин расположен еще реже (см. выше).

Каналы (поры) в мембранах, вероятно образуются вблизи молекул белков и выстланы полярными группами [113]. Природа и строение каналов — одна из актуальных проблем физики мембран.

В мембранах, по-видимому, существуют и более жесткие кри­сталлические участки. В них может реализоваться дислокацион­ная подвижность [114].

Ряд фактов свидетельствует о конформационных переходах в мембранах. Им посвящено множество работ; в частности, изу­чались структурные изменения, связанные с электрической ак­тивностью возбудимых мембран. Как уже указывалось на стр. 142, структурные изменения обнаруживаются при помощи флуоресцентных и парамагнитных меток [115, 116], а также при измерении двойного лучепреломления [117—119] и рассеяния света [117, 120, 121]. В работах [122—124] изменения параметров люминесценции присоединенных к мембране красителей, сопро­вождающие возбуждение, также рассматривались как резуль­таты конформационных переходов (см. [96]).

Существенную информацию дают измерения кругового ди­хроизма (КД), свойства, особенно чувствительного к структур­ным перестройкам оптически активных молекул. Измерения КД и оптической активности позволяют охарактеризовать конфор­мации белков в мембранах и их изменения (см., в частности, работу, проведенную на суспензиях мембран [125]).

Уверенная интерпретация всех этих интересных и важных данных, однако, затруднительна. Надо иметь в виду, что изме­нения оптических и спектральных свойств могут вызываться и просто перезарядкой мембраны — эффектами электрострикции, перемещением самих меток под действием электрического поля и т. д. [89].

Прямую информацию о конформационных свойствах мем­бран дает изучение наблюдаемых в них фазовых переходов, ко­торые можно трактовать как плавление липидов. Такой переход происходит вблизи 0°С при нагревании мембран митохондрий и микросом от —40°С [126]. Переходы наблюдаются методами флуоресценции, светорассеяния, дилатометрии. Они зависят от ряда факторов — от ионной силы окружающего раствора, от рН, от природы ионов [127, 128]. С помощью спин-метки в сус­пензии плазматических мембран, выделенных из фибробластов мыши, найдены характеристические температуры латерального разделения фаз в липидах. Для внешнего монослоя липидов та­кие переходы наблюдаются при 15 и 31 °С, для внутреннего — при 21 и 37 °С ([129], см. также [89, 92]).

Подвижность мембранных липидов и фазовые переходы в них определяются их конформационными свойствами. Плавление липидов происходит путем поворотной изомеризации углеводо­родных цепей — это конформационное плавление [130]. В этом смысле поведение мембранных липидов соответствует общим принципам молекулярной биофизики, согласно которым важ­нейшие свойства биополимеров связаны с их конформационной подвижностью [131].

Насыщенные углеводороды, парафины, кристаллизуются в форме сплошных гранс-ротамеров. При плавлении наряду с гранс-ротамерами появляются свернутые, или гош-ротамеры [130]. В жидких парафинах их концентрация порядка 10%. Это должно относиться и к углеводородным «хвостам» в липидах.

Фазовые переходы в липидах изучались детально. На рис. 3.10 показаны изменения с температурой теплоемкости и энтальпии раствора дипальмитоил-а-лецитина [132]. Наблю­даются два фазовых перехода — при 34 °С и особенно резкий при 41 °С. Рентгенограмма при температуре ниже перехода со­держит резкие дифракционные кольца, отвечающие расстоянию между цепями 4,8 А, при температуре выше перехода — диффуз­ное кольцо, отвечающее расстоянию между цепями 5,3 А. В жид - ко-кристаллическом липиде времена корреляции для СН2-групп
порядка 10~6—Ю-8 с, о чем свидетельствуют данные, получен­ные методами ЯМР и ЭПР [133, 134].

В работе Нагле предложена модельная статистическая тео­рия фазовых переходов в мембранных липидах [135]. В своей модели он исходит из того, что энергия системы определяется суммой энергии ротамеризации в цепи, энергии ван-дер-вааль - сова притяжения и энергии стерического отталкивания цепей. Переходы трактуются как переходы порядок — беспорядок. При расчетах предполагается, что модельные цепи располагаются на двумерной трехугольной или квадратной решетке. Воспользо­вавшись значениями разности энергий гош - и транс-ротамера, равной АЕ = 0,5 ккал на 1 моль связей, и параметра ван-дер - ваальсова притяжения, равного а = 5,2 ккал на 1 моль СН2-групп, Нагле получил для трехугольной модели резкий фа­зовый переход второго рода при 353К (опыт — 315К). При уменьшении а до 1 ккал/моль переход оказывается переходом первого рода. «Квадратная» модель дает худшие результаты. Слабый переход при 34 °С согласно [135] определяется измене­нием упорядоченности фосфатных «голов» липидов.

В работе Трейбле предложена теория транспорта молекул через липидную мембрану, основанная на тех же представле­ниях о ротамеризации углеводородных цепей [136]. Свернутые (гош) ротамеры трактуются как подвижные структурные де­фекты — «кинки», определяющие наличие малых свободных объемов в углеводородной фазе мембраны. Коэффициент диф­фузии этих «кинков» оценивается в Ю-5 см2/с; следовательно, такая диффузия — быстрый процесс. Транспорт малых молекул происходит в результате их попадания в указанные свободные объемы и миграции вместе с ними. Эта красивая идея дает модель «кинетических каналов» в мембране и позволяет вычис­лить ее проницаемость для воды в согласии с опытом.

В работе Марша развита статистическая механика фосфоли- пидных двуслойных мембран, учитывающая в явной форме ро - тамеризацию и межцепные стерические ограничения [137]. Ве­личина АЕ принимается равной 0,75 ккал/моль (в работе [136] АЕ = 0,8 ккал/моль). В разумном согласии с опытом вычислены изменения энтальпии и энтропии при плавлении двуслойного липида, являющемся фазовым переходом первого рода. Концен­трация дефектов согласуется с оценкой, данной в работе [136].

В работе [182] предложена модель фазовых переходов в фос- фолипидах, учитывающая наряду с ротамеризацией и крутиль­ные колебания (ср. также [130]).

Можно считать установленной конформационную природу жидко-кристаллических свойств мембран. Тем не менее теоре­тическое и экспериментальное исследование этих свойств пока лишь начато, и мы еще далеки от их полного понимания.

С указанными свойствами тесно связаны явления взаимо­действия мембран с различными лигандами, имеющие большое значение для физиологии и фармакологии.

Во многих случаях реакции клеточных мембран на присоеди­нение специфических лигандов имеют кооперативный характер. Зачастую кривые ответов мембраны и клетки на возрастающую концентрацию лиганда отклоняются от изотермы Ленгмюра и имеют небольшой изгиб [138], а в некоторых случаях перегиб оказывается и очень резким.

Так называемые колициногенные штаммы бактерий Esche­richia coli продуцируют макромолекулярные антибиотики — ко - лицины, способные убивать бактерии других, «чувствительных» штаммов Е. coli. При этом число молекул колицинов, нужное для того, чтобы убить одну бактерию, может быть очень малым, оно может даже равняться единице [139]. Гибель клетки опре­деляется изменением ряда ее биохимических функций. Тем са­мым, мембрану «чувствительной» клегки можно считать обла­дающей усилительными свойствами — рецепция одной молекулы служит триггером, вызывая макроскопические события в мас­штабе клетки.

По-видимому, триггерные процессы сходного типа реали­зуются в мембранах рецепторных клеток — при рецепции запаха и вкуса, а также при зрительной рецепции световых квантов (см. гл. 7). Предпринята успешная попытка моделировать мем­бранную рецепцию запаха.

Получены искусственные липидные мембраны, реагирующие на некоторые пахучие вещества (камфору, мускус, линалол, н. октиловый и н. амиловый спирты). В основу метода получения таких мембран положено изменение искусственных липидных мембран под действием компонентов соскоба обонятельной вы­стилки лягушки, подвергнутого ультразвуковой обработке. В присутствии ионов Na+ или Са++ мембраны реагируют на па­хучие вещества увеличением проницаемости. Этот эффект бло­кируется двухлористой ртутью, реагирующей с SH-группами белков. Показано, что в условиях, когда ответ мембраны на одно из пахучих веществ доведен до максимального уровня, мембрана сохраняет способность реагировать на другие паху­чие вещества. Молекулярный вес компонента обонятельной выстилки, способного сенсибилизировать искусственные ли­пидные мембраны к действию пахучих веществ, превышает 100000 [140].

Установлено, что некоторые лекарственные вещества влияют на температуру конформационного плавления лецитина [141]. Взаимодействие мембраны эритроцита с лекарственными веще­ствами исследовалось в работе [142]. Показано, что анионы внедряются во внешнюю сторону мембраны, растягивая внеш - ний монослой липидов, и деформируют таким образом клетку. Напротив, катионы (в частности, вещества, содержащие чет­вертичные аммониевые основания), внедряются во внутренний монослой липидов, причем деформация клетки имеет в этом случае противоположный характер.

Еще до построения динамической мозаичной модели Шанжё и его соавторы предприняли попытку объяснить кооперативное взаимодействие мембраны с лигандами. Они рассматривали мембрану как упорядоченную кооперативную систему, по­строенную из различных или идентичных протомеров, т. е. повторяющихся субъединиц [143, 144]. В работах Шанжё и его соавторов триггерные свойства мембраны трактуются на основе теории, аналогичной теории кооперативного пове­дения ферментов, предложенной Моно, Уайманом и Шанжё ([145], см. также [131], гл. 7). Каждый протомер имеет ре - цепторный центр для данного специфического лиганда, срод­ство к которому меняется при изменении конформации прото - мера. В упорядоченной «решетке» мембраны протомеры взаи­модействуют со своими соседями, чем и определяются коопера­тивные свойства.

Качественные результаты естественно получаются уже в про­стейшем случае двух конформационных состояний идентичных протомеров. Поведение системы описывается функцией состоя­ния и функцией связывания, отвечающих соответственно доле протомеров в одной из двух конформаций и доле центров, свя­завших лиганд. Энергии связывания в двух конформациях раз­личны. Задача решается в приближении молекулярного поля (см. [131], § 1.5). Параметр кооперативности определяется взаи­модействием между протомерами — предполагается, что энергия перехода между двумя конформациями линейно зависит от ука­занной функции состояния. Если кооперативности нет, то функ­ция состояния и функция связывания гиперболически зависят от активности лиганда, и получаются изотермы Ленгмюра. На­против, при наличии кооперативности эти зависимости S-об - разны и в пределе, при некотором критическом значении актив­ности лиганда, обе функции имеют разрыв, подобный фазовому переходу всей системы от одного конформационного состояния к другому.

В зависимости от активности лиганда и энергии взаимодей­ствия протомеров ответ мембраны на присоединение лиганда может быть постепенным или S-образным, становясь в пределе переходом типа «все или ничего».

Эти результаты, конечно, полностью соответствуют сделан­ным предположениям. Шанжё трактует с помощью описанной модели действие колицинов [147], механизм которого пока еще недостаточно изучен экспериментально. По-видимому, их дей­ствие связано с изменением катионной проницаемости мембран [146]. Та же модель применена к проблемам фармакологии [147]. Гипотеза Шанжё дает качественное объяснение ряду фактов, в частности, тому, что различные родственные лекарственные вещества вызывают различные максимальные ответы мембран. Можно считать установленным, что первичное действие лекарств локализовано в мембране и имеет кооперативный характер. Ле­карства действуют в очень малых концентрациях (вплоть до кон­центраций 10-11 М) и обладают высокой химической специфич­ностью. По-видимому, воздействие лекарств на рецептор опре­деляется молекулярным узнаванием (см. гл. 1); но о природе таких рецепторов известно еще очень мало (см., в частности, [148]).

Модель Шанжё является формальной и феноменологической. Она не учитывает реального строения мембран. Дальнейшее раз­витие этой термодинамической теории связано с рассмотрением нестабильностей, с применением формализма неравновесной тер­модинамики [149]. В ряде теоретических работ развита и кине­тика кооперативных процессов применительно к мембранам [150, 151]. Предложены кинетические модели кооперативного мем­бранного транспорта. Теория нелинейной кинетики строится с помощью модели Изинга. Осцилляционное поведение мембран рассматривается далее в § 8.9.

Теория мембранного транспорта и взаимодействия мембран с различными лигандами в дальнейшем будет основываться на рассмотрении реальных молекулярных моделей. Такого рода мо­дели, как уже сказано, с успехом применялись к рассмотрению фазовых переходов в двойном слое липидов. Главная трудность будущей теории состоит в анализе динамики взаимодействия белков и липидов. Мембранные рецепторы, — по-видимому, бел­ки (в случае фоторецепции это родопсин), — связавшись с ли­гандами, меняют свою конформацию, что приводит к изменению глубины погружения и подвижности белков в «липидном море». Причина кооперативности может лежать во взаимодействии «плавающих» белков при их столкновениях. Динамическая мо­заичная модель должна послужить основой реалистической мо­лекулярной физики мембран.

Можно считать, что конформационные свойства мембран оп­ределяются электронно-конформационными взаимодействиями (ЭКВ, см. [131, 152]). Локальный сдвиг электронной плотности, возникающий при взаимодействии рецептора мембраны с лиган - дом, влечет за собой конформационные перестройки биологиче­ских молекул. Тем более это относится к прохождению через мембрану заряженных ионов, которое можно трактовать как распространение конформонов [153] — условных квазичастиц, со­стоящих из носителя электрического заряда, или сдвига элек­тронной плотности и конформационных смещений окружающей среды. Такие представления особенно важны в применении к мембранам митохондрий и хлоропластов, в которых осуществ­ляется электронный транспорт (см. гл. 6, 7).