Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Радикалы, образующиеся при пиролизе

В первых же работах, посвященных исследованию биологи­ческих систем методом ЭПР, было обнаружено, что при карбони­зации органического материала при относительно низких темпе­ратурах образующиеся циклические углеродные конденсирован-

Ные системы содержат высокие концентрации неспаренных электро­нов [38, 39, 67]. Было показано, что независимо от природы исход­ного материала изменение концентрации неспаренных электронов (или свободных радикалов) с изменением температуры носит один та тот же характер. Результаты этих работ суммированы на фиг. 70. Можно видеть, что при приближении температуры карбонизации к 600° С концентрация захваченных неспаренных электронов (т. е. образование свободных радикалов) сильно увеличиваетсяг но при дальнейшем повышении температуры она резко надает, и при температуре выше 800° наблюдается лишь очень слабый сигнал ЭПР. В диапазоне температур между 1000 и 1500° С вообще антрацитах резко падает. Было показано, чтоКкак и в случае карбонизованного материала, понижение концентрации свободных радикалов сопровождается быстрым увелв 'гением электропровод ности исследуемых образцов, что свидетельствует об образовании не­больших графитоподобных плоских структур в углеродистом мате­риале. Исследование различных видов углейи антрацитов позволило провести довольно подробное сравнение с результатами исследо вания тех же веществ методом рентгеноструктурного анализа [41].

Результаты сравнения дают основания предполагать, что по мере роста циклической конденсированной системы в пиролизованном органическом материале (фиг^ 72) происходит захват неспаренных электронов. Таким образом, образование свободного радикала можно упрощенно представить себе как результат термического расщепления нормальных связей углерод — водород в процессе образования конденсированных углеродных колец. В ходе этого процесса одна^из крайних связей вокруг конденсированных угле­родных циклов нередко рвется с образованием свободного радикала и освобождением неспаренного электрона в циклическую углерод­ную систему, где он стабилизируется, переходя на молекулярную орбжталь большого радиуса в системе зт-связей вокруг этой цикли­ческой структуры. Исследования образцов древесного угля из неко­торых египетских пирамид показало, что концентрация свободных радикалов в нем все еще очень высока и близка к теоретической; такую высокую стабильность углеродных радикалов можно объяс­нить только наличием конденсированных циклических систем.

Сравнительно быстрое исчезновение сигнала, сопровождающее заметное увеличение электропроводности пиролизованного орга­нического вещества, можно объяснить тем, что начинается массовое объединение сопряженных углеродных колец и в результате замы­кания разорванных сопряженных связей образуются графитовые плоскости, которые и обусловливают электропроводность. Такие графитовые плоскости обладают электронами проводимости, но обусловленный ими спектр ЭПР должен очено сильно уширяться из-за дефектов структуры. Спектр ЭПР, обусловленный неспарен­ными электронами, возникающим! в процессе карбонизации при температуре 800—1500° С, будет, по всей вероятности, уширен настолько, что его невозможно будет обнаружить. Тот факт, что сигналы ЭПР дают некоторые органические вещества, карбони­зация которых происходила при гораздо более высоких темпера­турах, а также вещества с очевидной графитовой структурой [42], можно объяснить на основе той же теории. Так, можно считать, что эти сигналы связаны с проводимостью за счет переноса заряда (в отличие от сигналов, обнаруживаемых при более низкой темпе­ратуре, которые обусловлены свободными радикалам, локализо­ванным! на краях циклической углеродной структуры; обычно их называют «разорванными связями»).

Исследование изменения ширины линии таких сигналов, по-ви­димому, подтверждает эту точку зрения. Пока процентное содер­жание ^углерода не очень высоко, у всех низкотемпературных углей ширина линии одна и та же — поряка 10 Э. Эта ширина не меняется заметно ни при изменении концентрации неспаренных электронов, ни при изменении температуры. Поэтому было пред­положено, что она определяется неразрешенным расщеплением, возникающим в результате взаимодействия с окружающими про­тонам!, а не прямого взаимодействия с другими неспаренным! электронами или спин-решеточного взаимодействия с остальной молекулой. По мере превращения в графит ширина линии, однако, изменяется, что опять-таки может служит г, подтверждением изло­вленной выше простой схемы перехода от «разорванных связей» к «электронам проводимости».

Вскоре после идентификации этих радикалов было открыто очень интересное явление, известное теперь под названием «кис­лородного эффекта» [43, 44]. Было обнаружено, что если пиролиз углеродистого материала проводить в вакууме или в присутствии азота, то концентрация свободных радикалов оказывается очень высокой, но если затем в исследуемый образец допустить кисло­род, то по мере его диффузии через карбонизованный материал интенсивность сигнала быстро уменьшается. Этот эффект иллю­
стрируют кривые 1—6 на фиЛ|73. Самое поразительное свойство «кислородного эффекта» заключается в том, что при откачивании кислорода из образца процесс полностью обращается и при полной эвакуации кислорода снова наблюдается большой начальный сиг­нал. Этот эксперимент ясно показывает, что «кислородный эффект» имеет физическую, а не химическую природу и, следовательно, обусловлен каким-то взаимодействием между молекулами кисло­рода и неспаренными электронами углеродношструктуры. Дальней­шие исследования [45] показали, однако, что на самом деле здесь

I

4

Фиг. 73 Кислородный эффект в карбонизованных углях.

Объяснение см. в тексте.

Действуют дна различных механизма, так как в ряде случаев допуск в образец кислорода необратимо уменьшал сигнал и при последующем откачивании происходило лишь частичное его вос­становление. Эксперименты такого рода с одновременным изме­рением ширины линии подтверждают, по-видимому, что в этом случае имеют место два процесса — физическое уширение, свя­занное с поверхностной абсорбцией молекулярного кислорода и дипольным взаимодействием между молекулами кислорода и неспаренными электронами, и химическое взаимодействие, сопровояздающееся «спариванием» электронов, в результате кото­рого общее поглощение уменьшается необратимо.

Подробное выяснение механизмов превращений, происходящих с этими углеродистыми веществами, представляет собой крайне трудную задачу, так как природа самих образцов весьма сложна и трудно достигнуть их удовлетворительной воспроизводимости, Очень хороший обзор ранних работ по исследованию таких угле­родистых соединений методом ЭПР написан Синджером (46]. Успехи, достигнутые в этой области за последние годы, можно кратко подытожить следующим образом:

1. Подвергая карбонизации определенные органические моле­кулы в растворе, удалось получать на ранних стад: :ях г:арбониза-

11—1182
ции сигналы ЭПР с хорошо разрешенной сверхтонкой структурой, что позволило установить локализацию «разорванных связей» и образовавшихся свободных радикалов [47, 48].

2. Исследования Мрозовского [49] на высокотемпературных углях (выше 1500° С) наводят на мысль, что сигнал, по-видимому, состоит из двух компонент, из которых одна обусловлена локали­зованными центрами (и следовательно, подчиняется закону Кюри и характеризуется g-фактором, близким к 2,0023), а другая — электронами^ проводимости (т. е. изменяется с температурой в соответствии со статистикой Ферми — Дирака и имеет величину g-фактора больше 2,0023).

Мрозовский полагает, что между обеими этими разновидностями электронов имеет место обменное взаимодействие, в результате чего возникает синглетная линия с усредненными характеристи­ками. Исследование зависимости сигналов ЭПР от температуры, по-видимому, подтверждает существование двух таких компонент. Эксперименты показали, кроме того, что бомбардировка нейтро­нами увеличивает долю имеющихся в образце локализованных разорванных связей, тогда как введение примесей щелочных металлов увеличивает долю электронов проводимости.

3. Более тщательное исследование значений g-фактора, наблю­даемых в таких высокотемпературных графитовых углях, наводит на мысль о существовании корреляции между величиной фак­тор а и межплоскостнымн расстояниями и размерами кристаллита, с одной стороны [50], и диамагнитной восприимчивостью — с дру­гой [51].

Вскоре стало ясно, что такого рода исследования на пироли - зованном органическом материале могут найти применение в самых различных областях, в частности в угольной и нефтяной промыш­ленности, а также способствовать развитию теории катализа на угле (в том числе древесном). Было также осознано и чисто биологическое значение этих исследований. Например, естественно возникло предположение, что высокие концентрации неспаренных электронов в конденсированных циклических углеродистых систе­мах должны быть связаны с процессами канцерогенеза, особенно если принять во внимание, что такие вещества, как табачный дым и дымы, образующиеся при сгорании дизельных масел, содержат очень большие количества такого карбонизованного материала.

Чтобы выяснить, существует ли какая-либо прямая зависимость между измеренным содержанием неспаренных электронов и кан­церогенной активностью таких материалов, как табачный дым, был проведен ряд предварительных экспериментов [52]. Один из них проиллюстрирован на фиг. 74, где показан соединенный с насосом «курительный аппарат», в котором одновременно могут гореть четыре сигареты. Работа насоса создает в основной камере условия ритмичного всасывания, скорость которого и величина
разностного давления подбираются так, чтобы сигареты горели так же, как при обычном курении. Образующийся дым вытяги­вается в центральную сферическую камеру, от которой верти­кально вниз отходит узкий отросток, погруженный в дьюар с жидким азотом. Значительная часть дыма конденсируется на дне охлажденного отростка, и весь этот конденсированный материал, со держат, ий свободные радикалы, подвергается глубокому замо­раживанию, что предотвращает его дальнейшие химические превращения. Размеры сферической камеры и длина отростка подбираются таким образом, чтобы промежуток времени от образова­ния дыма до замораживания конден­сата был примерно равен времени, за которое дым проходит по дыхательным путям в легкие.

Вначале «курительный аппарат» ра­ботает в течение некоторого времени, чтобы на дне отростка скопилось доста­точное количество замороягенного^кон - денсата. Затем аппарат быстро перено­сят в предварительно охлажденный резонатор ЭПР-спектрометра и изме­ряют общее содержание свободных ради­калов в конденсате. Оно включает как стабильные радикалы, образующиеся, как было указано выше, при обычной карбонизации органического материала, так и всевозмояшые активные радикалы, которые образуются во время процесса курения, но не успевают прореагиро­вать друг с другом и рекомбинировать в течение тех нескольких секунд, за которые дым достигает замораживаю­щего отростка. Затем «курительный аппарат» извлекают из резонатора и кон­денсат нагревается до комнатной тем­пературы; его оставляют при этой температуре в течение 30 мин, после чего вновь замораживают, помещают в ЭПР-спектро - метр и повторно измеряют концентрацию свободных радикалов — теперь уже стабильных свободных радикалов, так как за то дли­тельное время, в течение которого конденсат находится при ком­натной температуре, все активные радикалы успевают рекомбини­ровать друг с другом и, следовательно, исчезают. Такие измерения, конечно, не давали хорошей воспроизводимости, но тем не менее их результаты четко показывают, что исходный дымовой конден­
сат содержит значительные количества как стабильных, так и ак­тивных свободных радикалов.

Присутствие в дымовом конденсате стабильных радикалов, связанных с конденсированными циклами пнролизованного орга­нического материала, не должно вызывать удивления, поскольку это вполне обычное явление. Однако присутствие более активных радикалов, исчезающих при нагревании до комнатной темпера­туры, показывает, что в сигаретном дыме имеются и более актив­ные агенты, которые при попадании в легочную ткань могут ак­тивно вступать в химические взаимодействия. В описанных выше предварительных опытах невозможно было, конечно, идентифи­цировать такие активные радикалы, но эти эксперименты ясно показали, что безусловно может существовать какая-то связь между содеря5анием неспаренных электронов и канцерогенной активностью. В следующем разделе мы рассмотрим исследова­ния, в которых для выяснения механизма канцерогенеза приме­нялись более сложные методические подходы, в том числе и метод электронного парамагнитного резонанса.