Электронный Парамагнитный резонанс в биологии

Общие свойства фертегшгативных реакций

Прежде чем перейти к конкретным приложениям метода ЭПР в исследовании различных ферментных систем, рассмотрим неко­торые общие свойства ферментативных реакций. В некоторых отношениях ферменты очень сходны с другими системами, изу­чаемыми методом ЭПР, но в то же время обладают рядом специ­фических свойств.

Прежде всего, фермент является катализатором, т. е. его функция заключается в увеличении скорости реакции. Концен­трация катализатора в реакциях такого рода теоретически остается неизменной, но на практике довольно часто оказывается, что скорость реакции прямо пропорциональна ей. Именно так обстоит дело в ферментативных реакциях. В отсутствие фермента ско­рость большинства из них практически равна нулю, так что гра­фик зависимости скорости реакции от концентрации фермента представляет собой прямую, проходящую через начало коор­динат.

-■„ Для ферментов характерна, однако, не только высокая эффек­тивность катализа, но и строгая специфичность по отношению к соединениям, превращения которых они катализируют. Эти соединения называются субстратами. Степень специфичности ферментов по отношению к субстратам неодинакова, и с этой точки зрения их можно разделить на четыре группы. К первой группе относятся ферменты, обладающие так называемой абсо­лютной специфичностью, т. е. катализирующие реакцию только с одним каким-либо субстратом. Примером такого рода может служить уреаза. Этот фермент катализирует гидролиз мочевины in двуокиси углерода и аммиака, но абсолютно инертен с дру - мши субстратами, даже если те обладают очень сходной хими­ческой структурой. Вторая группа включает ферменты с так на­чинаемой групповой специфичностью. Каждый из них действует па несколько субстратов, но все эти субстраты должны быть по - чожи и содержать какие-то одинаковые атомные группировки. Гак, фермент пепсин гидролизует лишь такие пептидные связи, по соседству с которыми в строго определенных положениях нахо­дятся ароматические группы. Ферменты третьей группы специ­фичны но отношению к определенному типу реакции или Гимической связи. Ферменты четвертой группы проявляют спе­цифичность к стереоизомерам субстратов. Например, лактатде - гидрогеназа катализирует окисление Z-молочноы кислоты, но не ее (/-изомера.

В основу классификации ферментов может быть положена не только их специфичность, но и типы катализируемых ими реак­ций. По этой классификации ферменты можно разделить на шесть основных групп.

1. Гидролитические ферменты, катализирующие реакции типа

АВ + Н20 —■ АОН+НВ.

Эта группа в свою очередь может быть подразделена на четыре класса в соответствии с природой гидролизуемых химических групп или связей.

2. Фосфоролитические ферменты, или фосфорилазы. В реак­циях, катализируемых этими ферментами, молекула фосфорной кислоты играет ту же роль, какую играет молекула воды в гидро­литических реакциях. В результате к субстрату присоединяется остаток фосфорной кислоты:

0 TOC o "1-3" h z О

1 1

АВ+НО—Р — ОН-*-АО—Р—OH-J-HB

I I

ОН он

3. Окислительные ферменты, катализирующие самые разно­образные окислительные процессы. Их тоже можно подразделить на ряд классов: 1) дегидрогеназы, катализирующие отрыв двух атомов водорода от молекулы субстрата; 2) оксидазы, катализи­рующие такой окислительный процесс, в котором атомы водо­рода переносятся непосредственно на молекулярный кислород; 3) окислительные дезаминазы, специфичные по отношению к амино- соединениям и катализирующие окисление с одновременным отры­вом молекулы аммиака (окислительное дезаминирование).

4. Ферменты, катализирующие реакции присоединения.

5. Ферменты, катализирующие реакции переноса групп.

6. Изомеризующие ферменты, катализирующие различные про­цессы изомеризации; большинство из них взаимодействует с фос- форилированными соединениями.

Конечно, такая классификация принята лишь для удобства и, вероятно, не отражает никаких фундаментальных закономер­ностей. Однако она достаточно хорошо иллюстрирует различные типы биохимических и химических реакций, в которых могут участвовать определенные группы ферментов.

В ранних исследованиях по энзимологии основное внимание фиксировалось на методах измерения кинетики ферментативных реакций. Эти результаты использовались затем для построения детального механизма реакции и характеристики образующихся в ходе реакции промежуточных продуктов.

Измерения скорости ферментативных реакций в зависимости от концентрации субстрата показали, что, как правило, при низ­ких концентрациях эта зависимость носит линейный характер (реакция первого порядка), но когда концентрация достигает достаточно высоких значений, скорость реакции перестает зави­сеть от количества субстрата, т. е. происходит переход от реак­ции первого порядка к реакции нулевого порядка. Теория этого процесса впервые была разработана Михаэлисом и Ментен [7]. По их представлениям, ферментативная реакция протекает в две стадии. Первая стадия — образование комплекса между фер­ментом и субстратом, вторая — распад этого комплекса на ко­нечные продукты реакции. Переход от кинетики первого порядка к условиям насыщения можно тогда объяснить тем, что при низ­ких концентрациях субстрата большинство молекул фермента свободны и лишь небольшая их часть связана с молекулами суб­страта. Но при возрастании концентраций субстрата до некото­рого определенного значения практически весь фермент связан в фермент-субстратных комплексах и дальнейшее повышение концентрации субстрата не может более привести к повышению концентрации комплекса и, следовательно, повлиять на скорость реакции. При более детальном изучении ферментных систем ока­залось, что на самом деле дело обстоит несколько сложнее, но это нисколько не умаляет важности кинетических исследований для изучения ферментативных реакций.

Основной недостаток применявшихся ранее методов состоял в том, что они не позволяли точно определять концентрацию про­межуточных комплексов, и потому кинетические исследования базировались на измерении концентрации начальных и конечных продуктов реакции. Информация о промежуточных стадиях чер­палась из моделей, по возможности близко соответствовавших наблюдаемой кинетической картине. В этом отношении метод ЭПР приобретает особенно большое значение, так как промежуточные продукты обычно содержат неспаренные электроны и на основа­нии спектров ЭПР их можно измерять и идентифицировать. Та­ким образом, этот метод дает гораздо более прямую информацию о промежуточных стадиях ферментативного процесса и позволяет непосредственно в эксперименте различать кинетику первичных и вторичных реакций. В остальной части этой главы мы покажем, каким образом метод ЭПР используется в исследовании механиз­мов конкретных ферментативных реакций.